Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi
Summary
Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.
Abstract
Replica inesatte in presenza di danno al DNA è responsabile della maggior parte dei riarrangiamenti cellulare e mutagenesi osservato in tutti i tipi di cellule ed è ampiamente creduto di essere direttamente associati con lo sviluppo del cancro negli esseri umani. Danno al DNA, come quella indotta da radiazioni UV, limita fortemente la capacità di replicazione di duplicare il modello di genomica con precisione. Un certo numero di prodotti genici sono stati identificati, che sono necessari quando la replicazione incontra le lesioni del DNA nel modello. Tuttavia, una sfida che rimane è stato quello di determinare come queste lesioni processo di proteine durante la replica<em> In vivo</em>. Utilizzando Escherichia coli come sistema modello, si descrive una procedura in cui bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare gli intermedi strutturali che sorgono su plasmidi replicare<em> In vivo</em> Segue indotte dai raggi UV danno al DNA. Questa procedura è stata utilizzata per dimostrare che le forcelle replica bloccato dal danno indotto dai raggi UV subiscono un'inversione transitoria che è stabilizzata da Reca e dei prodotti genici diversi relativi alla via RECF. La tecnica dimostra che questi intermedi replica vengono mantenute fino a un tempo che si correla con la rimozione delle lesioni da riparazione per escissione dei nucleotidi e riprende la replica.
Protocol
Discussion
I risultati tipici ottenuti da cellule di tipo selvatico in presenza e in assenza di danno indotto dai raggi UV sono mostrati in figura 1. In assenza di danni, ~ 1% del DNA totale plasmide si possono trovare nell'arco Y quando le cellule sono in rapida crescita in fase esponenziale. A seguito di irradiazione, un aumento transitorio delle molecole a forma di Y si osserva come le forcelle replica bloccato accumulano nei siti danneggiati. La forma di X intermedi replica anche transitoriamente si accumulano e persistono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro nel nostro laboratorio è supportato da premio CARRIERA MCB0551798 dalla National Science Foundation e AREA concedere R15GM86839 dal NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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