Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel
Summary
Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.
Abstract
Replicação imprecisa na presença de danos no DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celular e mutagênese observado em todos os tipos de células e é acreditado extensamente para ser diretamente associada ao desenvolvimento de câncer em seres humanos. Danos ao DNA, como a induzidas por radiação UV, severamente prejudica a capacidade de replicação para duplicar o modelo genômico com precisão. Uma série de produtos de genes foram identificados que são necessários quando a replicação de DNA encontros lesões no modelo. No entanto, um desafio restante foi para determinar como essas lesões proteínas processo durante a replicação<em> In vivo</em>. Usando Escherichia coli como um sistema modelo, descrevemos um procedimento no qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar os intermediários estruturais que surgem em plasmídeos replicar<em> In vivo</em> Seguinte UV induzida por dano ao DNA. Este procedimento tem sido utilizado para demonstrar que forquilhas de replicação bloqueada pelo UV induzida por danos sofrer uma reversão transitória que é estabilizado por RecA e produtos de genes associados com vários RecF o caminho. A técnica demonstra que esses intermediários de replicação são mantidas até que um tempo que se correlaciona com a remoção das lesões através de reparação por excisão de nucleotídeos e retoma a replicação.
Protocol
Discussion
Resultados típicos obtidos a partir de células de tipo selvagem, na presença e ausência de UV induzida por danos são mostrados na Figura 1. Na ausência de danos, cerca de 1% do DNA total plasmídeo pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial. Após a irradiação, um aumento transitório no Y moléculas em forma é observado como garfos de replicação bloqueados acumular em locais danificados. Os intermediários em forma de X replicação também transitoriame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho em nosso laboratório é apoiado pela concessão de CARREIRA MCB0551798 da National Science Foundation e conceder ÁREA R15GM86839 do NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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