Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis
Summary
Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.
Abstract
Replicación inexacta en la presencia de daño en el ADN es el responsable de la mayoría de los reordenamientos celulares y mutagénesis observado en todos los tipos celulares y se cree que estar directamente asociado con el desarrollo del cáncer en los seres humanos. Daños en el ADN, como la inducida por la radiación UV, que limita enormemente la capacidad de replicación de duplicar la plantilla de genómica precisa. Una serie de productos de los genes han sido identificados que son necesarios cuando se encuentra con la replicación de las lesiones del ADN en la plantilla. Sin embargo, un desafío pendiente ha sido la de determinar cómo estas lesiones proceso de las proteínas durante la replicación<em> In vivo</em>. Usando Escherichia coli como un modelo de sistema, se describe un procedimiento en el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar los intermedios estructurales que surgen en los plásmidos replicar<em> In vivo</em> Después de la radiación UV-inducida por daño en el ADN. Este procedimiento se ha utilizado para demostrar que las horquillas de replicación bloqueadas por el daño inducido por UV someten a una reversión transitoria que se estabiliza por Reca y varios productos de genes asociados con la vía RecF. La técnica demuestra que estos intermediarios de replicación se mantienen hasta el momento que se correlaciona con la eliminación de las lesiones de reparación por escisión de nucleótidos y se reanuda la replicación.
Protocol
Discussion
Los resultados típicos obtenidos a partir de células de tipo salvaje en presencia y ausencia de daño inducido por UV se muestra en la Figura 1. En la ausencia de daños, aproximadamente el 1% del ADN total de plásmido se puede encontrar en el arco Y cuando las células están creciendo rápidamente en la fase exponencial. Después de la irradiación, un aumento transitorio de las moléculas en forma de Y se observa como las horquillas de replicación bloqueadas se acumulan en los sitios dañados. Los intermediarios …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo en nuestro laboratorio con el apoyo de Career Award MCB0551798 de la Fundación Nacional de Ciencia y AREA conceder R15GM86839 de la NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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