Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Summary

Zebrafisch als leistungsfähige entstanden<em> In vivo</em> Plattform für Phänotyp-basierten Wirkstoff-Bildschirme und chemisch-genetischen Analyse. Hier zeigen wir eine einfache, praktische Methode zur groß angelegten Screening von kleinen Molekülen mit Zebrafisch-Embryos.

Abstract

Aufgrund ihrer kleinen Größe Embryo, schnelle Entwicklung, Transparenz, Fruchtbarkeit und zahlreichen molekularen, morphologischen und physiologischen Ähnlichkeiten zu den Säugetieren, hat Zebrafisch als leistungsfähige entstanden<em> In vivo</em> Plattform für Phänotyp-basierten Wirkstoff-Bildschirme und chemisch-genetischen Analyse. Hier zeigen wir eine einfache, praktische Methode zur groß angelegten Screening von kleinen Molekülen mit Zebrafisch-Embryos.

Protocol

1) Zebrafisch Egg Collection Am Nachmittag vor dem Tag der chemischen Bildschirm einrichten 10 bis 20 Zebrafisch Zuchtbecken. Füllen Sie die einzelnen Behälter mit Wasser aus der Aquakultur System. Mit einem Fangnetz, Transfer ein erwachsenes Männchen und 1-2 erwachsenen Weibchen zu Innenbehälter in jedem Aufzuchtbecken. Separate der männlichen und weiblichen Fische voneinander mit einem Teiler. Beschriften Sie die Käfige und einen Deckel über sie. Am Morgen des Bildschirms, entfernen Sie die…

Discussion

Bei der Planung eines Zebrafisch-basierte chemische Bildschirm, muss besonderes Augenmerk auf die Robustheit der Phänotyp unter Berücksichtigung der Hintergrund von solchen Phänotyp bezahlt werden. Dies ist besonders wichtig für Bildschirme für chemische Suppressoren einer induzierten Phänotyp. Zum Beispiel für einen Phänotyp durch Hitze-Schock-Induktion einer Transgen hervorgerufen, die Bedingung, dass der Phänotyp induziert reproduzierbar muss genau abgebildet werden aus vor Beginn der Bildschirm zu unvertret…

Materials

1. Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
2. Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
3. Petri dishes (10 cm).
4. Plastic tea strainer.
5. Wash bottle containg embryo water.
6. Disposable polyethylene transfer pipettes.
7. Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
9. Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
11. 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12. 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
13. Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
15. Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
18. Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).