בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine,Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology,Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology,Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS,Vanderbilt University School of Medicine
Summary
דג הזברה התפתחה חזקה<em> In vivo</em> פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
Abstract
לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה<em> In vivo</em> פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
Protocol
1) דג הזברה אוסף ביצה באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר…
Discussion
כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
- Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
- Petri dishes (10 cm).
- Plastic tea strainer.
- Wash bottle containg embryo water.
- Disposable polyethylene transfer pipettes.
- Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
- Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
- Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
- E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
- 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
- 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
- Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
- Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
- Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
- DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
- Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
- Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).
References
- Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
- Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
- Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
- Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).
Cite This Article
Hao, J., Williams, C. H., Webb, M. E., Hong, C. C. Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen. J. Vis. Exp. (46), e2243, doi:10.3791/2243 (2010).