Summary

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

Published: June 13, 2011
doi:

Summary

Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour la préparation de leucocytes infiltrant le cerveau (Bils) de souris. Nous démontrons comment infecter des souris avec le virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) via une technique d'injection intracrânienne rapide et comment purifier une population leucocytaire enrichi des cellules infiltrant du cerveau entier. Brièvement, les souris sont anesthésiés à l'isoflurane dans une chambre fermée et sont main-libre injecté avec une seringue Hamilton dans le cortex frontal. Les souris sont ensuite tués à différents moments après l'infection par surdose isoflurane et cerveaux entiers sont extraits et homogénéisé dans du RPMI avec un broyeur de tissus Tenbroeck. Homogénats de cerveaux sont centrifugés à travers un gradient de Percoll à 30% continue d'éliminer les débris cellulaires et d'autres myéline. La suspension cellulaire est alors tendu à 40 um, lavés et centrifugés sur un discontinu de Ficoll-Paque plus dégradé à sélectionner et à purifier les leucocytes. Les leucocytes sont ensuite lavées et resuspendues dans des tampons appropriés pour l'immunophénotypage par cytométrie en flux. La cytométrie en flux révèle une population de cellules immunitaires innées aux stades précoces de l'infection chez les souris C57BL / 6. A 24 heures après l'infection, multiples sous-ensembles de cellules immunitaires sont présentes dans le Bils, avec une population enrichie de Gr1 +, CD11b + et + F4/80 cellules. Par conséquent, cette méthode est utile pour caractériser la réponse immunitaire à une infection aiguë dans le cerveau.

Protocol

1. Injection du virus intracrânienne: La technique suivante a été modifié et largement utilisée par notre laboratoire et ses collègues. Brièvement, l'injection intracrânienne de souche du Daniel de virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) ou fictive-infection (1, 10) est réalisée sur des souris jeunes (de préférence 5-6 semaines d'âge) pour obtenir des leucocytes infiltrant le cerveau (Bils). S'il vous plaît noter que les résultats diffèrent entre les souche…

Discussion

Nous utilisons régulièrement la cytométrie en flux pour déterminer la qualité de la préparation des cellules du cerveau infiltrer, et de distinguer les différentes populations de cellules immunitaires 2, 9. A aiguë du temps des points, notre méthode Bils rendements des pourcentages élevés de monocytes inflammatoires au sein de la population CD45hi ainsi que de forts pourcentages de macrophages dans la population CD45lo. Cela indique que la réponse immunitaire dans reproductibles le cerveau peut ê…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention NS64571 du NINDS (CLH), par une sentence de développement en début de carrière de la Mayo Clinic (CLH), et par un généreux don de Donald et Frances Herdrich (CLH). Nous tenons à remercier la Clinique Mayo de débit de base de cytométrie de l'aide.

Materials

Reagent Company Catalog number Comments
TMEV Howe Lab N/A  
Daniel’s strain Invitrogen 21063-029  
isoflurane Novaplus NDC 0409-3292-49  
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0030  
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093  
Percoll GE Healthcare 17-0891-02  
10X PBS Roche 11666789001  
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02  
Trypan Blue 0.4% (w/v) Mediatech 25-900-CI  
15 ml conical tubes BD Falcon 352097  
7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder Fisher 08-414-10B  
40 μm cell strainer BD Falcon 352340  
50 mL conical BD Falcon 352070  
bovine serum albumin Sigma A9647  
sodium azide Sigma S8032  
CMF-PBS Mediatech 21-040-CV  
FACS tubes BD Falcon 352054  
fetal bovine serum Sigma F4135  
2.4G2 hybridoma ATCC HB-197  
Costar V-bottom plate Corning 3894  
Allegra X-22R centrifuge or equivalent Beckman N/A  
96-well plate bucket and rotor Beckman S2096  
Fixed-angle rotor Beckman F0360  
paraformaldehyde Sigma P6148  
BD FACS Calibur BD Biosciences N/A  
FlowJo 7.5 Tree Star, Inc. N/A  
CD45 BD Biosciences 557235 clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G) BD Biosciences 553128 clone: RB6-8C5
CD11b ebiosciences 17-0112-83 clone: M1/70
F4/80 ebiosciences 17-4801-82 clone: BM8

References

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Cite This Article
LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747, doi:10.3791/2747 (2011).

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