Summary

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

Published: June 13, 2011
doi:

Summary

Быстрый метод получения проникновения лейкоцитов из мышиного мозга описывается. Этот метод использует непрерывный градиент Перколла и разрывные градиент Ficoll, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов обогащенного слоя. Изолированные лейкоцитов может затем быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии измерений.

Abstract

Мы опишем способ получения мозг проникают лейкоциты (BILS) от мышей. Мы показываем, как заразить мышей с мышиным энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) с помощью быстрой внутричерепного технике инъекций и как очистить лейкоцитов обогащенного населения проникают клетки весь мозг. Короче говоря, мышей анестезировали изофлуран в закрытой камере, и от руки вводят с помощью шприца Гамильтона в лобной коре. Мыши затем убили в разное время после заражения изофлуран передозировки и весь мозг извлекаются и гомогенизировали в RPMI с мясорубки ткани Tenbroeck. Мозг гомогенатах центрифугируют через непрерывный 30% Перколла градиента, чтобы удалить миелина и другой клетке мусора. Клеточной суспензии затем напряженными при 40 мкм, промывают и центрифугируют на разрывной Ficoll-Paque Плюс градиента, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов. Лейкоциты, затем промывали и ресуспендировали в соответствующие буферы для иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия выявляет населения врожденных иммунных клеток на ранних стадиях инфекции в C57BL / 6 мышей. Через 24 часа после инфекции, несколько подмножеств иммунные клетки присутствуют в BILS, с населением обогащенных Gr1 +, CD11b + и F4/80 + клеток. Таким образом, этот метод полезен при характеристике иммунного ответа на острую инфекцию в мозгу.

Protocol

1. Внутричерепное инъекции вируса: Следующий прием был модифицирован и использован широко в нашей лаборатории и коллег. Короче говоря, внутричерепное введение штамма Даниила мышиных энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) или фиктивных-инфекции (1, 10) проводится на молодых мыше…

Discussion

Мы регулярно пользоваться проточной цитометрии для определения как качества мозг проникают ячейки подготовки, и различать различные популяции иммунных клеток, 2, 9. При острых временных точках, наши BILS метод дает высокий процент воспалительных моноцитов в CD45hi населения, а также в…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом NS64571 от NINDS (CLH), на ранних награду развития карьеры из клиники Майо (CLH), а щедрый подарок от Дональда и Фрэнсис Herdrich (CLH). Мы хотели бы поблагодарить потока клиники Майо цитометрии основной для получения помощи.

Materials

Reagent Company Catalog number Comments
TMEV Howe Lab N/A  
Daniel’s strain Invitrogen 21063-029  
isoflurane Novaplus NDC 0409-3292-49  
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0030  
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093  
Percoll GE Healthcare 17-0891-02  
10X PBS Roche 11666789001  
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02  
Trypan Blue 0.4% (w/v) Mediatech 25-900-CI  
15 ml conical tubes BD Falcon 352097  
7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder Fisher 08-414-10B  
40 μm cell strainer BD Falcon 352340  
50 mL conical BD Falcon 352070  
bovine serum albumin Sigma A9647  
sodium azide Sigma S8032  
CMF-PBS Mediatech 21-040-CV  
FACS tubes BD Falcon 352054  
fetal bovine serum Sigma F4135  
2.4G2 hybridoma ATCC HB-197  
Costar V-bottom plate Corning 3894  
Allegra X-22R centrifuge or equivalent Beckman N/A  
96-well plate bucket and rotor Beckman S2096  
Fixed-angle rotor Beckman F0360  
paraformaldehyde Sigma P6148  
BD FACS Calibur BD Biosciences N/A  
FlowJo 7.5 Tree Star, Inc. N/A  
CD45 BD Biosciences 557235 clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G) BD Biosciences 553128 clone: RB6-8C5
CD11b ebiosciences 17-0112-83 clone: M1/70
F4/80 ebiosciences 17-4801-82 clone: BM8

References

  1. Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
  2. Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
  3. Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
  4. Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
  5. Donovan, J., &amp, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
  6. Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
  7. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
  8. Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
  9. Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
  10. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).

Play Video

Cite This Article
LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747, doi:10.3791/2747 (2011).

View Video