وتستخدم الحد المقايسات زرع الخلايا لتحديد تخفيف وتيرة نشر خلايا الورم. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد الزرد مسانج أن fluorescently بسرطان الدم المسمى وتفاصيل كيفية عزل وزرع هذه الخلايا في الحد من سرطان الدم التخفيف في التجويف البريتوني من الزرد الكبار.
الخلايا السرطانية الذاتي تجديد هي أنواع الخلايا السرطانية فقط في غضون التي لديها قدرة غير محدودة لتشجيع نمو الورم ، وبالتالي فهي معروفة للورم خلايا التكاثر ، أو خلايا الورم البدء. ويعتقد أن استهداف هذه الخلايا ذاتية تجديد لتدمير ستمنع تطور الورم ومنع الانتكاس ، وتحسين تشخيص المريض كثيرا 1. الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد وتيرة الذاتي تجديد خلايا الورم داخل خلية تخفيف الحد مقايسة لزراعة الأعضاء ، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية في الحيوانات المتلقي بجرعات متزايدة ، وتستخدم نسبة من الحيوانات التي تطور الأورام وحساب عدد في تقرير المصير ، تجديد الخلايا السرطانية داخل العينة الأصلي 2 ، 3. من الناحية المثالية ، سوف تستخدم عددا كبيرا من الحيوانات في كل تجربة تخفيف تحد لتحديد بدقة وتيرة نشر خلايا الورم. ومع ذلك ، وتجارب واسعة النطاق تشمل الفئران هي مكلفة ، ومعظم المقايسات تخفيف الحد من استخدام الفئران فقط 10-15 في التجربة.
وقد اكتسبت شهرة الزرد كنموذج السرطان ، في جزء كبير نظرا لسهولة التلاعب بها الوراثية والاقتصاد التي يمكن أن يؤديها تجارب واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على أكثر أنواع السرطان على غرار لتقليد في الزرد عن كثب على نظيره 4 الأمراض التي تصيب البشر. في حين أنه من الممكن زراعة خلايا الورم من الأسماك إلى آخر عن طريق شبه قاتلة تشعيع الحيوانات المتلقية ، وتجديد النظام المناعي بعد 21 يوما وغالبا ما يسبب انحسار الورم 5. وقد سهلت إنشاء مؤخرا الزرد مسانج الدراسات زرع ورم كبير 6-8. يمكن رصدها لهذه الحيوانات ، زرع خلايا متطابقة جينيا تدبر الورم بقوة في الأسماك المستفيدة ، ونمو الورم على مدى فترات طويلة من الزمن. مسانج الزرد مثالية للحد من المقايسات زرع التخفيف في أن الخلايا السرطانية لم يكن لديك على التكيف مع النمو في المكروية الأجنبية ، الأمر الذي قد يقلل الذاتي تجديد الخلايا تردد 9 و 10. بالإضافة إلى ذلك ، واحدة وقد تم زرع الخلايا بنجاح باستخدام الزرد مسانج (8) وعدة مئات من الحيوانات ويمكن بسهولة واقتصاديا زرع في وقت واحد ، وكلاهما يعمل على تقديم تقديرات أكثر دقة للتجديد الذاتي تردد الخلية.
هنا ، يقدم وسيلة لخلق الابتدائية ، T – الخلية fluorescently الحادة التي تحمل علامات سرطان الدم الليمفاوي (T – ALL) في مسانج الزرد ، وزرع هذه الأورام في الحد من التخفيف في الأسماك البالغة لتحديد الذاتي تجديد تردد الخلية. بينما يرد اللوكيميا كمثال ، فإن هذا البروتوكول هو مناسبة لتحديد وتيرة نشر ورم الخلايا باستخدام أي نموذج السرطان في الزرد.
ان نقطة القوة الرئيسية لاستخدام الزرد في أبحاث السرطان والتي يمكن استخدامها أعداد كبيرة من الحيوانات وبتكلفة منخفضة نسبيا. وهذا أمر مهم لا سيما في مجال الحد المقايسات تخفيف زرع الخلايا ، التي تستخدم فيها نسب من الحيوانات التي تطور الأورام المزروعة إلى العدد الإجمالي لتحديد زرع ورم بدء تواتر الخلية. في أسلوب المعروضة هنا ، وتستخدم أكثر من 70 عملية زرع الحيوانات المتلقي في مقايسة ، وتقديم تقدير دقيق لعدد خلايا الورم نشر. وينبغي أن يكون الأمثل كلا من عدد الحيوانات المستخدمة وجرعة من الخلايا السرطانية المزروعة لنموذج معين السرطان ، على سبيل المثال ، إذا تبين التجارب الأولية للورم الخلايا بدء نادرة ، قد تكون مفيدة زرع جرعات 100000 ، 50000 ، 10000 و 1000 في الخلايا زرع.
مسانج سلالات الزرد مفيدة في الحد من تحليل التخفيف. ومع ذلك ، لم يتم حتى الآن هذه السلالات التي يشيع استخدامها في جميع المختبرات ، وبعض النماذج من سرطان الزرد وجود لها إلا في الأسماك خيفي. يمكن إجراء عمليات زرع الخلايا الحد التخفيف في البرية من نوع السلالات التي خضعت الاجتثاث المناعي ، وإن كان من المحتمل أن يحسب تردد خلية الذاتي وتجديد 1-10 أضعاف أعلى مما لو استخدمت مسانج الزرد 8. ومن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي استخدام جرعات أكبر من الخلايا للزرع في غير مأمن المتلقين ، مطابقة للإشعاع ، وبعض الخلايا السرطانية لن يكتب له البقاء في زرع المكروية الأجنبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأورام تبدأ في التراجع بعد 21 يوما عند الحيوان المتلقي النظام المناعي للشفاء ، لذا يجب أن يتم تقييم الحيوانات لنمو الورم في كل 7 أيام بعد الزرع.
الأساليب المقدمة هنا هي مناسبة للاستخدام مع أي نموذج سرطان الزرد ، وحتى الآن استخدمت لتحديد الورم بدء تردد في كل خلية تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد 8 ، ونموذجا الأورام الصلبة ، العضلية المخططة 16. وfluorescently المسمى هذه الأورام عن طريق الحقن المشترك للأجنة مع الجين الورمي على حد سواء ، وعلامة فلوري ، لأن الحمض النووي المشترك تفصل ، أي خلية التعبير عن الجين الورمي وأعرب أيضا عن بروتين فلوري 17. بينما يوصى مضان لأن يسهل تتبع نمو الورم دون الحاجة إلى التضحية الحيوانية ويوفر طريقة مباشرة إلى الأمام لعزل الخلايا السرطانية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، فإنه من الممكن تسمية الخلايا السرطانية مع الأجسام المضادة للورم محددة لتسهيل صناع تنقية بهم ، على الرغم من الأجسام المضادة قد تلطيخ في الزرد تتطلب التحسين.
أخيرا ، مرة واحدة وقد تم تحديد حدوث ورم نشر خلايا الورم لنوع معين ، فمن الممكن استخدام هذه المقايسات لتحديد الآليات التي تحكم وتيرتها الخلية. على سبيل المثال ، يمكن علاج الخلايا السرطانية الأولية مع مثبطات محددة قبل تحديد مسار التخفيف زرع ، أو السمك يمكن زرعها مداوي أنفسهم مع المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم التلاعب في الصفات الوراثية للأورام أنفسهم عن طريق حقن الأسماك مرحلة واحدة مع الخلية الجينات في المصالح ، بحيث يؤدي الأورام الابتدائية والافراط في التعبير عن الجينات. في هذه التجارب ، سوف يلاحظ أي تأثير على تجديد الذات وتيرة خلية في المقايسات تخفيف محدود.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم توفير التمويل من خلال المنح NIH 5T32CA09216 – 26 (لJSB) ، وK01 AR055619 – 01A1 و 3 K01 AR055619 – 03S1 (لDML) ، وكذلك من قبل مؤسسة عصير الليمون حامل اليكس ، والخلايا الجذعية معهد هارفارد والسرطان الأمريكية المجتمع.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |