Ограничение разбавления анализов клеточной трансплантации используются для определения частоты опухолей, распространяющихся клеток. Этот протокол описывает метод генерации сингенных данио, которые развиваются флуоресцентно меченных лейкемии и детали, как изолировать и трансплантации этих клеток лейкемии на ограничение разведения в брюшную полость взрослых рыбок данио.
Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment.
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.
Одна из основных сильных использованием данио в исследовании рака является то, что большое количество животных могут быть использованы при относительно низких затратах. Это особенно важно в ограничении разведения клеточной трансплантации анализов, где пропорции трансплантированных животных, которые развиваются опухоли к общему числу пересаженных используются для определения опухоль начала ячейки частоты. В метод, представленный здесь, более 70 животных пересадка получателя используются в анализе, обеспечивая точную оценку опухоль распространяется числа клеток. Оба числа животных, используемых и дозы опухолевых клеток пересаженного должен быть оптимизирован для данной модели рака, например, если начальные эксперименты показывают, опухоли, инициирующие клетки встречаются редко, полезной дозы пересадки может быть 100 000, 50000, 10000 и 1000 клеток на трансплантата.
Сингенных штаммов данио полезны в ограничении разведения анализа. Однако, эти штаммы не часто используется во всех лабораториях, а некоторые модели данио рака существуют только в аллогенных рыбы. Ограничение трансплантации разбавления клетки может быть выполнена в штаммов дикого типа, которые подверглись иммунной абляции, хотя самообновлению ячейки частота может быть рассчитана как 10-100 раз выше, чем если бы сингенных данио были использованы 8. Важно отметить, что в больших дозах клеток должны быть использованы для трансплантации в неиммунных совпадают, облученных реципиентов, так как некоторые опухолевые клетки не выживет пересадки на иностранный микроокружения. Кроме того, многие опухоли начнут регрессировать после 21 дней, когда иммунная система получателя животного восстанавливается, так что животные должны быть оценены для роста опухоли каждые 7 дней после пересадки.
Методы, представленные здесь, являются подходящими для использования с любыми данио модели рака, и до сих пор используется, чтобы определить опухоль начала ячейки частотой в обеих Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза 8 и твердотельной модели опухоли, рабдомиосаркома 16. Эти опухоли были помечены флуоресцентно совместного введения эмбрионов с обеих онкогенов и флуоресцентного маркера, потому что ДНК со-сегрегации, любой ячейке выражения онкоген также выразить флуоресцентный белок 17. Хотя флуоресценции рекомендуется, поскольку это облегчает отслеживание роста опухоли без необходимости жертвовать животных и обеспечивает прямой вперед способ изолировать опухолевых клеток путем FACS, можно маркировать опухолевых клеток с антителами к опухоли конкретных производителей для облегчения их очистки , хотя антитела окрашивания в данио рерио могут требовать оптимизации.
Наконец, когда частота опухолей, распространяющихся клеток было определено для данного типа опухоли, можно использовать эти анализы для выявления механизмов, которые управляют их ячейки частоты. Например, клетки первичной опухоли можно лечить с помощью специфических ингибиторов путь до предельного разбавления трансплантации, или пересаженной рыбы сами по себе могут быть дозированным с наркотиками. Кроме того, генетики опухолей сами по себе могут манипулировать, вводя один-клеточной стадии рыбы с интересующего гена, так что в результате первичной опухоли будет более-экспресс гена. В этих опытах, никакого влияния на самообновлению ячейки частоты будет наблюдаться в предельных тестах разбавления.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование было предоставлено NIH гранты 5T32CA09216-26 (для АБ) и K01 AR055619-01A1 и 3 K01 AR055619-03S1 (для DML), а также Алекса Лимонад Стенд фонда, Гарвардский Институт Стволовых Клеток и Американского онкологического Общество.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |