有限稀释细胞移植试验是用来确定传播肿瘤细胞的频率。本协议描述了一个产生,发展荧光标记的白血病和细节,如何限制稀释到成年斑马鱼的腹腔这些白血病细胞分离和移植的同源斑马鱼的方法。
自我更新的癌细胞内肿瘤的细胞类型有无限的能力,促进肿瘤的生长,从而传播肿瘤细胞或肿瘤细胞。它被认为是针对销毁这些细胞自我更新将阻止肿瘤的进展和停止复发,大大提高了患者的预后1。最常用的方法来确定的频率自我更新在肿瘤细胞,是一个限制稀释细胞移植实验,其中肿瘤细胞移植到受体动物剂量的增加;开发肿瘤的动物的比重是用于计算数量自我更新的细胞内原发肿瘤样本2,3。理想的情况下,大量的动物将被用来在每个有限稀释实验,以准确地确定传播肿瘤细胞的频率。然而,大规模的实验,涉及小鼠是昂贵的,最重要的限制稀释检测只用10-15%的实验小鼠。
斑马鱼已获得了作为癌症模型中的突出地位,在很大程度上是由于其易于遗传操作和可以进行大规模实验的经济。此外,在斑马鱼为蓝本的癌症类型,已发现密切模仿其对应的人类疾病4。虽然有可能从一条鱼的肿瘤细胞移植亚致死照射收件人动物的免疫系统在21天以后的再生,往往导致肿瘤缩小5。同基因斑马鱼的最近成立大大促进了肿瘤移植研究 6-8 。由于这些动物的基因完全相同,移植的肿瘤细胞嫁接到收件人的鱼,和肿瘤的生长健壮,可长时间监测。同基因斑马鱼是理想的限制稀释移植,肿瘤细胞检测,没有适应生长在国外的微环境,这可能低估了细胞的自我更新频率 9 ,10。此外,一个细胞移植已成功完成8斑马鱼的同源和数百个动物,可以很容易地和经济移植在同一时间,这两个服务提供一个更准确的估计,自我更新的细胞频率。
在这里,一种方法是建立小学,荧光标记的T细胞急性淋巴细胞性白血病(T – ALL的)在同基因斑马鱼,移栽在这些肿瘤的限制稀释到成年的鱼,以确定细胞自我更新频率。虽然白血病为例,该协议是合适的,以确定肿瘤细胞传播,使用任何癌症模型中的斑马鱼的频率。
一个在癌症研究中使用斑马鱼的主要优势在于可以在相对较低的成本使用大量的动物。这是特别重要的限制稀释细胞移植实验,开发移植动物肿瘤移植总数的比例用于确定肿瘤启动细胞频率。在这里介绍的方法,用于移植的动物超过70%检测,提供了一个传播肿瘤细胞数量的准确估计。使用动物的数量和移植的肿瘤细胞的剂量应为一个给定的癌症模型优化;例如,如果初步实验表明,肿瘤细胞,是罕见的,有用的移植剂量可10万元,50000,10000和1000细胞每移植手术。
斑马鱼的同源菌株有限稀释分析是有用的。然而,这些菌株尚未常用在所有的实验室,和一些斑马鱼的癌症模型中只存在异体鱼。有限稀释细胞移植可以在野生型菌株发生免疫消融,虽然细胞的自我更新频率可能比如果斑马鱼的同源共使用8高出10-100倍计算。重要的是要注意,应移植到非免疫匹配,照射收件人使用更大剂量的细胞,某些肿瘤细胞就无法生存移植到外国的微环境。此外,许多肿瘤会开始倒退21天以后,当收件人动物的免疫系统恢复正常,因此应评估肿瘤生长移植后每7天的动物。
这里介绍的方法适用于使用任何斑马鱼癌症模型,迄今被用来确定肿瘤启动细胞的频率,在T细胞急性淋巴细胞白血病 8,和实体瘤模型,横纹肌肉瘤 16 。这些肿瘤合作与癌基因和荧光标记的胚胎注射荧光标记,因为DNA的合作隔离,任何表达的原癌基因的细胞也将表达荧光蛋白17。虽然,因为它有助于追踪肿瘤的生长,而不需要牺牲动物,并提供了一个直接的方法,分离肿瘤细胞,流式细胞仪,荧光建议,它是可能的肿瘤细胞与抗肿瘤特异性厂商的抗体标志,以方便其净化的,但在斑马鱼的抗体染色,可能需要优化。
最后,一旦传播肿瘤细胞的发病率已经被确定为一个给定的的肿瘤类型,它有可能使用这些检测,以确定的机制,执政的细胞频率。例如,原发肿瘤细胞可以被视为与途径的特异性抑制剂,限制稀释移植,或移植鱼本身可能与药物剂量。此外,肿瘤本身的基因可能会操纵一个感兴趣的基因注入一个细胞阶段鱼,使产生的原发性肿瘤过度表达的基因。在这些实验中,影响细胞自我更新频率,将在限制稀释实验观察。
The authors have nothing to disclose.
资金已被提供由美国国立卫生研究院拨款5T32CA09216 – 26(对JSB),和K01 AR055619 – 01A1和3 K01 AR055619 – 03S1(对于DML),以及在Alex的柠檬水架基金会,在哈佛大学干细胞研究所和美国癌症学会。
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |