Summary

发展的细胞类型特异性的抗艾滋病毒gp120基因的siRNA传递适配

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

从RNA库是孤立的几个2' -氟RNA对HIV – 1BA – L的gp120的nanomole亲和力的适配<em>在体外</em> SELEX程序。创建一种新的双抑菌功能抗- gp120的适配子的siRNA的嵌合体,显示了相当的全身抗艾滋病毒治疗的承诺。

Abstract

全球艾滋病毒感染疫情已创建了一个新类抗逆转录病毒药物的迫切需要。很强的能力,抑制小分子干扰(SI)的RNA互补的RNA转录表达是被人利用作为一个新类的疗法,为各种疾病,包括艾滋病毒。许多以前的报告表明,新型RNAi为基础的治疗策略anti-HIV/AIDS有相当大的承诺,然而,成功的siRNAs的临床治疗中的应用和翻译的一个主要障碍是有效地提供。特别是,考虑RNAi为基础的疗法的安全性和有效性,它是非常可取的,制定有针对性的细胞内的siRNA传递到特定的细胞群体或组织的方法。 HIV – 1的gp120的蛋白质,对HIV – 1病毒表面的糖蛋白的信封,到病毒进入CD4细胞起着重要作用。已通过验证的触发HIV – 1项,并启动细胞融合的gp120与CD4的相互作用作为临床相关的抗病毒的药物发现策略。

在此,我们首先讨论2' – F改性抗- HIV的gp120基因的RNA适配子的选择和鉴定。使用传统的硝化纤维过滤器SELEX方法,几个新的适配纳摩尔亲和力,从50个随机NT RNA文库中分离。为了成功地获得绑定的物种具有较高的亲和力,选择紧缩小心控制调整的条件。选定适配特异性结合,并迅速进入细胞表达的HIV – 1包膜蛋白的内化。此外,单独的适配,可中和HIV – 1病毒的传染性。根据最好的适体A – 1中,我们还创建了一种新型的双抑菌功能抗- gp120的适配子的siRNA的嵌合体适体和siRNA的部分具有强大的抗艾滋病毒的活动。此外,我们利用gp120的适体的siRNA嵌合体细胞类型特定的siRNA传递到HIV – 1感染细胞。这种双重功能的嵌合体,显示了相当大的潜力相结合的各种核酸治疗剂(适体和siRNA)抑制HIV – 1感染,使适配子的siRNA嵌合体,没有高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)的患者有吸引力的治疗候选人。

Protocol

1。制备的RNA库起始的DNA库中包含50个核苷酸的随机序列,并结合DNA技术(Coralville,衣阿华)合成。单链DNA寡核苷酸库序列为5' – GGG AGG的ACG ATG CGG公司- N 50 – CAG的ACG ACT的CGC CCG一个- 3“(81新台币)。随机区域的两侧是由不断的地区, 其中包括在体外转录的T7启动子和3'标签用于RT – PCR。 5'和3'恒定序列5' – TAA交咨会GAC TCA CTA的豪GGA GGA CGA TGC GG – 3“(32 MER)和5'?…

Discussion

适配是在体外进化承担具体的和稳定的三维形状的核酸,从而提供了非常具体的,紧密结合到目标分子 8 。低纳摩尔结合的亲和力和精致的特异性适配,他们的目标,使他们的多用途工具用于诊断,在体内成像治疗9。随着适体进行有针对性的siRNA传递技术的到来,现在是可行的,使用的适体为受体介导的内吞作用 siRNA 10-12的绑定功能。对细胞膜受体提出?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢布丽塔赫恩,孙桂花,哈里斯Soifer有益的讨论和莉萨舍雷尔。这项工作是支持通过美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考试剂计划,艾滋病司,NIAID的,美国国立卫生研究院从国立卫生AI29329,授予JJR下列试剂HL07470研究院获得资助的CHO – EE和CHO – gp160细胞行; pNL4 – 3吕克载体; gp120的HIV – 1 BAL DAIDS,NIAID的。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
MF-Millipore membrane filter Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806  
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024  
DuraScribe T7 transcription Kit EpiCentre DS010925  
dNTP for PCR Roche 1 581 295  
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein the AIDS Research and Reference Reagent Program 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit – Cy3 Ambion 1632  
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720  
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma C0549  
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England BioLab M0290L  
T4 polynucleotide kinase New England BioLab M0201L  
Glycogen Roche 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedical 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850  
10xTBE National Diagnostics EC-860  
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281  
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678  
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg  
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030  
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094  
Minimum Essential Medium (MEM) (10) Invitrogen 11430-030  
MEM non-essential amino acid (100) Invitrogen 11140-050  
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01  

References

  1. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  2. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  3. Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
  4. Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
  5. Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
  6. Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
  7. Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
  8. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
  9. Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
  10. Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
  11. McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
  12. Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
  13. Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
  14. Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).

Play Video

Cite This Article
Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

View Video