Summary

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Vários aptâmeros 2'Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por RNA<em> In vitro</em> Processo de SELEX. A nova dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera é criado e mostra a promessa considerável para a terapia anti-HIV sistêmica.

Abstract

A epidemia global de infecção por HIV criou uma necessidade urgente de novas classes de agentes anti-retrovirais. A potente capacidade da pequena interferência (si) RNA para inibir a expressão de transcritos complementares RNA está sendo explorado como uma nova classe de tratamentos para uma variedade de doenças incluindo o HIV. Muitos relatórios anteriores mostraram que o romance baseado em RNAi anti-HIV/AIDS estratégias terapêuticas têm a promessa considerável, no entanto, um obstáculo chave para o êxito da aplicação terapêutica e tradução clínica de siRNAs é a entrega eficiente. Particularmente, considerando a segurança e eficácia de terapias baseadas em RNAi, é altamente desejável desenvolver uma abordagem de entrega prevista intracelular siRNA para populações de células ou tecidos específicos. O HIV-1 proteína gp120, uma glicoproteína do envelope na superfície do HIV-1, desempenha um papel importante na entrada do vírus nas células CD4. A interação de gp120 e CD4 que desencadeia HIV-1 de entrada e inicia a fusão celular foi validado como clinicamente relevante estratégia anti-viral para a descoberta de drogas.

Aqui, nós em primeiro lugar discutir a seleção e identificação de 2'-F modificado anti-HIV gp120 aptâmeros RNA. Utilizando um método convencional SELEX nitrocelulose filtro, várias aptâmeros novo com afinidade nanomolar foram isolados a partir de 50 nt RNA aleatórias biblioteca. A fim de conseguir obter espécies presos com maior afinidade, o rigor de seleção é cuidadosamente controlado, ajustando as condições. O aptâmeros selecionados podem se ligam especificamente e ser rapidamente internalizado nas células expressando a proteína do HIV-1 envelope. Além disso, o aptâmeros sozinho pode neutralizar o HIV-1 infectividade. Com base no melhor aptamer A-1, também criamos um romance dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera em que ambos os aptamer e as porções siRNA têm potentes atividades anti-HIV. Além disso, nós utilizamos a gp120 aptamer siRNA-quimeras para a célula do tipo de entrega específico do siRNA para HIV-1 células infectadas. Esta dupla função quimera mostra um potencial considerável para a combinação de vários agentes terapêuticos de ácido nucléico (aptamer e siRNA) na infecção por HIV-1 suprimindo, tornando-as quimeras aptamer siRNA atraente candidatos terapêuticos para pacientes com falha terapêutica anti-retroviral altamente ativa (HAART).

Protocol

1. Preparação da biblioteca de RNA A biblioteca de DNA a partir continha 50 nucleotídeos das seqüências aleatórias e foi sintetizada pelo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). O DNA de fita simples seqüência biblioteca oligo é 5'-GGG AGG ATG ACG CGG – N 50 – CAG CGC CCG ACG ACT A – 3 '(81 nt). A região aleatória é flanqueado por regiões constantes, que incluem o promotor T7 para transcrição in vitro e um 3 tag 'para RT-PCR. A 5 'e 3' se…

Discussion

Aptâmeros são in vitro evoluiu ácidos nucléicos que assumem específica e estável formas tridimensionais, proporcionando assim altamente específico, forte ligação às moléculas alvo 8. A afinidade nanomolar baixa ligação e especificidade requintado de aptâmeros a seus alvos torná-los ferramentas versáteis para diagnóstico, in vivo de imagem e terapêutica 9. Com o advento da tecnologia aptamer para entrega siRNA alvo agora é possível usar a função de li…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer e Lisa Scherer para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e AI29329 HL07470 concedido a JJR Os seguintes reagentes foram obtidos através da AIDS NIH Programa de Pesquisa e de reagente de referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH: O CHO-EE e CHO-gp160 celular linha, a pNL4-3 luc vetor; HIV-1 BaL gp120 de DAIDS, NIAID.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
MF-Millipore membrane filter Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806  
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024  
DuraScribe T7 transcription Kit EpiCentre DS010925  
dNTP for PCR Roche 1 581 295  
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein the AIDS Research and Reference Reagent Program 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit – Cy3 Ambion 1632  
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720  
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma C0549  
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England BioLab M0290L  
T4 polynucleotide kinase New England BioLab M0201L  
Glycogen Roche 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedical 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850  
10xTBE National Diagnostics EC-860  
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281  
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678  
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg  
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030  
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094  
Minimum Essential Medium (MEM) (10) Invitrogen 11430-030  
MEM non-essential amino acid (100) Invitrogen 11140-050  
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01  

References

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Cite This Article
Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

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