Summary

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Varios fluoro-2'-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN por<em> In vitro</em> Procedimiento SELEX. Un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera se crea y se muestra muy prometedora para sistémica anti-VIH.

Abstract

La epidemia mundial de infección por el VIH ha creado una necesidad urgente de nuevas clases de fármacos antirretrovirales. La potente capacidad de interferente pequeño (si) ARN para inhibir la expresión de los transcritos de ARN complementarias está siendo explotado como una nueva clase de terapias para una variedad de enfermedades incluyendo el VIH. Muchos informes anteriores han demostrado que las nuevas estrategias basadas en el ARNi terapéutico anti-HIV/AIDS tienen una considerable promesa, sin embargo, un obstáculo clave para la exitosa aplicación terapéutica y la traducción clínica de siRNAs es la prestación eficiente. Sobre todo, teniendo en cuenta la seguridad y la eficacia de tratamientos basados ​​en el ARNi, es muy conveniente para desarrollar un planteamiento selectivo de la entrega del siRNA intracelulares a las poblaciones de células o tejidos específicos. El VIH-1 proteína gp120, un sobre glicoproteína en la superficie del VIH-1, juega un papel importante en la entrada del virus en las células CD4. La interacción de la gp120 y CD4 que provoca el VIH-1 de entrada e inicia la fusión de células ha sido validado como clínicamente relevante antivirales estrategia para el descubrimiento de fármacos.

Aquí, en primer lugar, discutir la selección e identificación de los 2'-F modificado aptámeros anti-gp120 del VIH ARN. Utilizando un método SELEX filtro de nitrocelulosa convencionales, varios aptámeros nuevo con afinidad nanomolar fueron aislados de un 50 al azar de la biblioteca nt ARN. Con el fin de recabar las especies vinculado con una mayor afinidad, el rigor de la selección está cuidadosamente controlada mediante el ajuste de las condiciones. Los aptámeros seleccionadas pueden unirse específicamente y de forma rápida internaliza en las células que expresan la proteína de envoltura del VIH-1. Además, los aptámeros el único que puede neutralizar el VIH-1 infectividad. Sobre la base de la mejor aptamer A-1, también creamos un nuevo doble función inhibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA quimera en la que tanto el aptámero y las partes han siRNA potente contra el VIH actividades. Además, utilizamos la gp120 siRNA aptamer quimeras para la entrega del tipo de células específicas de los siRNA en el VIH-1 las células infectadas. Esta función dual quimera muestra un considerable potencial de la combinación de varios agentes de ácidos nucleicos terapéuticos (aptámero y siRNA) en la supresión de la infección por VIH-1, por lo que las quimeras siRNA aptamer atractivo candidatos terapéuticos para pacientes que no la terapia antirretroviral altamente activa (HAART).

Protocol

1. Preparación de la biblioteca de ARN La biblioteca de ADN a partir contenía 50 nucleótidos de las secuencias aleatorias y se sintetizó por Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). La única secuencia de ADN de cadena de la biblioteca es oligo 5'-GGG AGG ACG ATG CGG – N 50 – CAG ACG ACT CGC CCG A – 3 '(81 nt). La región de azar está flanqueado por las regiones constantes, que incluyen el promotor T7 para la transcripción in vitro y la etiqueta de un 3 'p…

Discussion

Los aptámeros son in vitro desarrollado ácidos nucleicos que asumen específica y estable formas tridimensionales, proporcionando muy específicos, la unión estrecha de moléculas específicas 8. La baja afinidad nanomolar vinculante y especificidad exquisita de aptámeros a sus objetivos que sean versátiles herramientas de diagnóstico, imágenes in vivo, y la terapéutica 9. Con el advenimiento de la tecnología aptamer para la entrega de siRNA objetivo ahora es pos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Britta Hoehn, Sun Guihua, Soifer Harris y Lisa Scherer útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y AI29329 HL07470 otorgado a JJR Los siguientes reactivos fueron obtenidos a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de reactivos de referencia, la División de SIDA, NIAID, NIH: el Cho-EE y de células CHO-gp160 línea, el pNL4-3 luc vector, el VIH-1 gp120 BaL de DAIDS, el NIAID.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
MF-Millipore membrane filter Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806  
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024  
DuraScribe T7 transcription Kit EpiCentre DS010925  
dNTP for PCR Roche 1 581 295  
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein the AIDS Research and Reference Reagent Program 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit – Cy3 Ambion 1632  
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720  
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma C0549  
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England BioLab M0290L  
T4 polynucleotide kinase New England BioLab M0201L  
Glycogen Roche 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedical 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850  
10xTBE National Diagnostics EC-860  
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281  
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678  
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg  
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030  
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094  
Minimum Essential Medium (MEM) (10) Invitrogen 11430-030  
MEM non-essential amino acid (100) Invitrogen 11140-050  
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01  

References

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Cite This Article
Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

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