Summary

Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

Published: September 17, 2011
doi:

Summary

Une méthode pour préparer translation active, synaptoneurosomes intacte (SNS) de la souris cortex cérébral est décrite. La méthode utilise un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose permettant la préparation rapide de SNS active.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) sont obtenus après homogénéisation et fractionnement de cortex cérébral de la souris. Ils sont refermés vésicules ou des terminaux isolés que rompre avec terminaisons axonales lorsque le tissu cortical est homogénéisé. Le SNS conserver des caractéristiques pré-et post-synaptiques, ce qui les rend utiles dans l'étude de la transmission synaptique. Ils conservent la machinerie moléculaire utilisée dans la signalisation neuronale et sont capables d'absorption, le stockage et la libération de neurotransmetteurs.

La production et l'isolement de SNS active peut être problématique médias utilisant comme Ficoll, qui peuvent être cytotoxiques et nécessitent une centrifugation prolongée due à haute densité, et la filtration et des méthodes de centrifugation, ce qui peut entraîner une faible activité en raison de dommages mécaniques de la SNS. Cependant, l'utilisation des gradients de densité discontinu de Percoll-sucrose pour isoler SN fournit une méthode rapide pour produire de bons rendements de SNS translation active. La méthode du gradient Percoll-sucrose est rapide et en douceur car il emploie des conditions isotoniques, a fait tourner la centrifugation moins nombreux et plus courts et évite les étapes de centrifugation que les SRS granulés et causer des dommages mécaniques.

Protocol

1. Les préparatifs 1-4 Préparer tampon de 500 mL de milieu de gradient (GM) en mélangeant 50 ml d'une suspension de 2,5 M de saccharose, 2,5 mL d'un 1M Tris-HCl, pH 7,5 stock, et 0,1 mL d'une EDTA 0,5 M, pH 8,0 milli-actions avec Q eau au volume. Filtre stériliser la solution, et de stocker aliquot congelé. Préparer un stock de 1000x de tétrodotoxine (TTX) en faisant une solution à 1 mM dans milli-Q H 2 O. Des aliquotes de TTX peuvent être stockés à -20 ?…

Discussion

La préparation gradient discontinu de Percoll-sucrose décrite ici est une méthode rapide et fiable d'isoler actifs SN, qui peut être utilisé dans une variété d'expériences de la transmission synaptique. Cette méthode de gradient, qui est basé sur la méthode développée par Dunkley et al., 3,4 est une procédure cerveau subcellulaire fractionnement qui isole à la fois pré-et post-synaptiques à la membrane des vésicules dérivées qui sont associés à un autre. Sans autre purification d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier BK août de l'Université de Wisconsin-Madison Facilité microscope électronique pour la microscopie électronique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DA026067 et P30-HD03352 (pour la JSM).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce 23235  
CaCl2 Fisher C79-500  
CO2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50  
EDTA RPI E57020  
EtOH Fisher A407SK-4  
HCl Fisher A142-212  
Percoll GE Healthcare 17-0891-01  
KH2PO4 Fisher P285-500  
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit Pierce 89888  
NaCl RPI S23020  
NaHCO3 Fisher BP328-500  
Na2PHO4 Fisher S381-500  
Sucrose RPI S24060  
Tris Base RPI T60040  
Tetrodotoxin Sigma T5651  
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag Perkin Elmer NEG772  
       
Equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Dissection tools      
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) Wheaton    
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602  
Allegra 6KR Centrifuge Beckman Coulter 366830  
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor Beckman Coulter 360581  
Beckman J2-21 Centrifuge Beckman    
Beckman tubes with caps Beckman 355672  
White walled adapters Beckman 342327  
Blue walled adapters Beckman    
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor Beckman 369691  

Table of antibodies used for western blots:

Name of Antibody Company Catalogue number Host Species Dilution Factor
β-Actin Sigma A5441 mouse 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 rabbit 1:200
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse 1:200
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 goat 1:200
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 rabbit 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 mouse 5 μg/μL
SNAP25 AbCam ab5666-100 rabbit 1:2000
Synaptophysin Millipore MAB368 mouse 1:500
β-3-Tubulin Santa Cruz sc-80016 mouse 1:200

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Cite This Article
Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).

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