不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製
Summary
マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。
Abstract
Synaptoneurosomes（SNS）は、マウス脳皮質の均質化と分別の後に得られる。彼らは、小胞または皮質組織が均質化されたときに軸索末端からの脱却孤立端末が再シールされています。 SNはシナプス伝達の研究に有用になる前と後シナプスの特性を、保持する。彼らは神経シグナリングで使用されている分子機構を保持して取り込み、ストレージ、および神経伝達物質の放出が可能です。
アクティブなSNの生産と分離は、細胞毒性になるとSNの機械的損傷に起因する低活性につながる可能性の拡張、高密度のために遠心分離し、ろ過と遠心分離の方法を、必要とすることができるフィコール、のような問題に使用してマスコミのすることができます。しかし、SNを分離するために、不連続パーコール-ショ糖密度勾配の使用は、並進アクティブSNの良好な収率を生成するために迅速な方法を提供する。パーコール-ショ糖密度勾配法では、等張性の条件を採用して、迅速かつ穏やかであり少ないと短い遠心分離スピンを持っており、ペレット、SNSとは、機械的損傷を引き起こすことに遠心操作を避けることができます。
Protocol
1。準備1月4日 で、2.5 Mのショ糖のスラリー50mLを、1Mトリス – 塩酸2.5mLを、pH7.5株式、および0.5 M EDTA 0.1 mLを混合してpH8.0のストックを勾配培地（GM）バッファーを500mLを準備ミリボリュームへのQ水。凍結溶液、分注して店を滅菌フィルタします。 ミリ- Q H 2 Oで1 mM溶液を作ることによってテトロドトキシン（TTX）の1000倍の株式を準備TTXのアリコートを-20℃で保存す…
Discussion
ここに記載さ不連続パーコール-ショ糖勾配の準備は、シナプス伝達の実験の様々な使用することができるアクティブなSNを、分離するために迅速、信頼性の高い方法です。 Dunkleyら、3,4によって開発された方法に基づいてこの勾配法は、互いに関連付けられている両方の前およびシナプス後膜由来の小胞を分離した細胞内脳分画の手順です。さらに精製することなくこれらのSNは免疫?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は電子顕微鏡のためのウィスコンシン大学マディソン電子顕微鏡施設の大学からBKアウグスト感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金R01 – DA026067とP30 – HD03352（JSMへ）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 |
Table of antibodies used for western blots:
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species | Dilution Factor |
|---|---|---|---|---|
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit | 1:200 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat | 1:200 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit | 1:200 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 μg/μL |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit | 1:2000 |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |
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Tags
SynaptoneurosomesMouse CortexDiscontinuous Percoll-Sucrose Density GradientHomogenizationFractionationResealed VesiclesIsolated TerminalsSynaptic TransmissionPre- And Postsynaptic CharacteristicsNeuronal SignalingNeurotransmittersFicollCytotoxicCentrifugationFiltrationMechanical DamagePercoll-sucrose Gradient MethodTranslationally Active SNsIsotonic Conditions
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Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).