불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비
Summary
마우스 뇌 피질에서 translationally 활성화, 손상 synaptoneurosomes (SNS)를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 활성화된 SNS의 빠른 준비를 위해 허용하는 불연속 Percoll – 자당 밀도 기울기를 사용합니다.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS)는 마우스 뇌 피질의 균질화 및 분별화 후 얻을 수 있습니다. 그들은 vesicles 또는 대뇌 피질의 조직이 균질 때 축삭 터미널에서 멀리 휴식 격리 터미널을 resealed 있습니다. SNS는 시냅스 전달의 연구에 유용하게하는, 사전과 postsynaptic 특성을 보유합니다. 그들의 연결 신호에 사용되는 분자 기계를 유지하고 이해, 스토리지 및 신경 전달 물질의 릴리스 할 수 있습니다.
적극적인 SNS의 생산과 격리 세포 독성하고 의한 SNS의 기계적 손상이 낮은 활동에 발생할 수 고밀도, 그리고 여과 및 원심 분리 방식에 의한 확장 원심 분리를 요구할 수 Ficoll 같은 문제를 사용하여 medias 수 있습니다. 그러나, SNS를 분리 불연속 Percoll – 자당 밀도 그라디언트의 사용 translationally 적극적인 SNS의 좋은 수율을 생산하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 펠렛 SNS 그리고이 기계 고장의 원인이되는, isotonic 조건을 고용하고 적은 짧은 원심 분리를 돌면서을 보유하고 원심 분리 단계를 피할 수로 Percoll – 자당 기울기 방법은 신속하고 부드러운 있습니다.
Protocol
1. 준비 1-4 2.5 M의 자당 슬러리의 50 ML을 혼합하여 500 그라디언트 매체의 ML (GM) 버퍼를 준비, 1M 트리스 – HCL, pH7.5 주식 및 0.5 m EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1 ML 2.5 ML, 산도와 8.0 주식 밀리 볼륨 Q 물. 솔루션 나누어지는 및 저장 냉동을 소독 필터. 밀리 Q H 2 O.에서 1 ㎜ 솔루션을 만들어 테트로도톡신 (TTX)의 1000x 재고를 준비 TTX의 Aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있…
Discussion
여기에 설명된 불연속 Percoll – 자당 기울기 준비는 시냅스 전송 실험의 다양한 사용할 수 있습니다 적극적인 SNS를 분리하기 위해 빠르고 안정적인 방법입니다. Dunkley 외., 3,4가 개발한 방법을 기반으로 그라데이션이 방법은 서로 관련된 두 – 사전 및 postsynaptic 멤브레인 – 파생 vesicles를 분리 subcellular 두뇌 분획화 절차입니다. 더 정화 않고 이러한 SNS가 immunoprecipitation, 서부 blotting, 유동?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전자 현미경에 대한 위스콘신 매디슨 전자 현미경 시설의 대학에서 BK 8 월 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 – DA026067 및 P30 – HD03352 (JSM)을 지원했다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 |
Table of antibodies used for western blots:
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species | Dilution Factor |
|---|---|---|---|---|
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit | 1:200 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat | 1:200 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit | 1:200 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 μg/μL |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit | 1:2000 |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |
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SynaptoneurosomesMouse CortexDiscontinuous Percoll-Sucrose Density GradientHomogenizationFractionationResealed VesiclesIsolated TerminalsSynaptic TransmissionPre- And Postsynaptic CharacteristicsNeuronal SignalingNeurotransmittersFicollCytotoxicCentrifugationFiltrationMechanical DamagePercoll-sucrose Gradient MethodTranslationally Active SNsIsotonic Conditions
Cite This Article
Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).