Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Summary

Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile qui maintiennent les protéines membranaires (les députés) au sein d'une bicouche lipidique, mais ont un comportement de phase unique qui facilite criblage à haut débit par les robots de cristallisation. Cette technique a réussi à produire un certain nombre de structures à haute résolution provenant des deux sources procaryotes et eucaryotes. Cette vidéo décrit les protocoles pour générer le mélange lipidique bicelle, en incorporant les députés dans le mélange bicelle, la mise en place des essais cristallisations (manuellement ainsi que robot) et des cristaux de la récolte à partir du milieu.

Abstract

Les protéines membranaires (les députés) jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques tels que le pompage des molécules spécifiques à travers la bicouche membranaire contraire imperméable qui entoure toutes les cellules et les organelles. Altérations de la fonction du résultat de députés dans plusieurs maladies et affections humaines, ainsi, une compréhension complexe de leurs structures demeure un objectif essentiel pour la recherche biologique. Cependant, la détermination des structures de députés demeure un défi important souvent issus de leur hydrophobicité.

Les députés ont d'importantes régions hydrophobes incorporé dans la bicouche. Les détergents sont fréquemment utilisés pour solubiliser ces protéines de la bicouche générant une micelle protéines de détergent qui peuvent ensuite être manipulés d'une manière semblable que les protéines solubles. Traditionnellement, les essais de cristallisation se faire en utilisant un mélange de protéines de détergent, mais ils résistent souvent à produire des cristaux de cristallisation ou de mauvaise qualité. Ces problèmes surviennent en raison de lal'incapacité du détergent pour bien imiter la bicouche résultant en une mauvaise stabilité et de l'hétérogénéité. En outre, les boucliers de détergent à la surface hydrophobe de la MP en réduisant la surface disponible pour les contacts de cristal. Pour contourner ces inconvénients députés peut être cristallisé dans les médias lipidique, qui reproduit plus fidèlement leur environnement endogène, et est récemment devenu une technique de novo pour la cristallisation MP.

Lipidique phase cubique (LCP) est une bicouche lipidique en trois dimensions pénétré par un système interconnecté de canaux aqueuse à ^1. Bien monooléine est le lipide de choix, les lipides connexes tels que monopalmitolein et monovaccenin ont également été utilisés pour faire LCP ^2. Les députés sont incorporés dans le LCP où ils diffusent en trois dimensions et des noyaux de cristal nourrir. Un grand avantage de la LCP est que la protéine reste dans un environnement plus natif, mais la méthode a un certain nombre d'inconvénients techniques, y compris visc hauteosity (nécessitant des appareils spécialisés) et des difficultés dans la visualisation et la manipulation de cristal ^3,4. En raison de ces difficultés techniques, nous avons utilisé un autre support lipidique pour la cristallisation-bicelles ^5,6 (figure 1). Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile formé par le mélange d'un lipide phosphatidylcholine (DMPC) avec un amphiphile (CHAPSO) ou un lipide à chaîne courte (DHPC). Dans chaque disque bicelle, les molécules lipidiques génèrent une bicouche tandis que la ligne amphiphile des molécules apolaires fournissant les bords des propriétés bénéfiques des deux bicouches et des détergents. Surtout, en dessous de leur température de transition, la protéine-bicelle mélanges ont une viscosité réduite et sont manipulés d'une manière semblable comme détergent solubilisées députés, rendant bicelles compatible avec les robots de cristallisation.

Bicelles ont été utilisées avec succès à cristalliser plusieurs protéines membranaires ^5,7-11 (tableau 1). Cette collection croissantedes protéines démontre la polyvalence de bicelles de cristalliser deux hélice alpha et feuillet bêta députés à partir de sources procaryotes et eucaryotes. En raison de ces succès et la simplicité de mise en œuvre à haut débit, bicelles devrait faire partie de l'arsenal tous les cristallographe protéines de la membrane. Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie bicelle et de fournir un protocole étape par étape pour la mise en place des essais de cristallisation à haut débit des députés purifiée en utilisant la robotique standard.

Protocol

Bicelle cristallisation base se compose de quatre étapes de base (figure 2): i) préparation d'un bicelle lipidique formant: mélange amphiphile; ii) l'incorporation de la protéine purifiée dans le milieu bicelle; iii) des essais de cristallisation (manuellement ou de manière robotisée), et iv) visualisation, l'extraction et le gel de cristal. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous 1. Préparation de bicelles Bicelles peuvent se former da…

Discussion

Bicelles sont un support unique lipidique qui offrent un natif bicouche-comme l'environnement tout en se comportant comme si solubilisées par des détergents. Cette propriété donne bicelles un net avantage sur les autres méthodes de cristallisation à base de lipides car il n'y a pas de courbe d'apprentissage ou de l'équipement spécialisé requis pour cette technique. Une fois bicelles sont disponibles, que ce soit commercial ou préparé dans le laboratoire, ils peuvent être directement mélangé…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMPC	Affymetrix	D514
CHAPSO	Affymetrix	C317
Ready-to-use Bicelles	MemX Biosciences	MX201001/MX201002
Crystallization Screens	Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience		Standard commercially available screens can be used for initial screening
Crystallization Set-up			Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used.