脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化
Summary
Bicellesは、脂質二重層内での膜タンパク質（MPS）を維持するが結晶化ロボットによるハイスループットスクリーニングを容易にするユニークな相挙動を持っている脂質/両親媒性物質混合物である。この手法は、正常に原核生物と真核生物の両方のソースから高解像度の構造体の数を生産している。このビデオでは、結晶化の試験を設定する（手動でだけでなく、ロボット制御）と媒体から結晶を収穫、bicelle混合物中にMPを搭載した、脂質bicelleの混合物を生成するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
膜タンパク質（MPS）は、全ての細胞や小器官を囲むそうでなければ不透過性の膜二重層を介して特定の分子を汲み上げるなど、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。多くの人間の病気や障害のMPが結果の機能の変化、したがって、その構造の複雑な理解は、生物学的研究にとって重要な目標のまま。しかし、国会議員の構造決定は、しばしばそれらの疎水性に起因する重要な課題である。
国会議員は、二重層内に埋め込まれた実質的な疎水性領域を持っている。洗剤は、頻繁にして可溶性タンパク質と同様に操作することができるタンパク質 – 界面活性剤のミセルを生成する二重層からこれらのタンパク質を可溶化するために使用されます。伝統的に、結晶化試験では、タンパク質 – 界面活性剤混合物を使用し、処理を続行しますが、彼らはしばしば結晶化に抵抗または低品質の結晶を作り出す。これらの問題が原因で起こる洗剤のできないことは、十分に安定性が低いと不均一で、その結果二重層を模倣する。さらに、洗剤のシールドはMPの疎水性表面は、結晶接触のための利用可能な表面積を減らすことができます。回避するためにこれらの欠点のMPは、より密接に彼らの内因性の環境をシミュレートする脂質メディア、で結晶化することができ、最近ではMPの結晶化のためのde novoの技術となっている。
脂質キュービック相（LCP）は水性のチャンネル1の相互接続されたシステムが貫通三次元脂質二重層である。モノオレインの選択の脂質ですが、そのようなmonopalmitoleinやmonovacceninなどの関連脂質はまた、LCP 2を作るために使用されている。国会議員は、彼らは三次元とフィード結晶核の拡散LCPに組み込まれています。 LCPの大きな利点は、タンパク質がより多くのネイティブ環境に残っていることですが、この方法は、高viscを含む技術的な欠点がいくつかありますosity（特殊な装置を必要とする）と結晶可視化と操作3,4の難しさ。なぜなら、これらの技術的困難さから、我々は、結晶化- bicelles 5,6（ 図1）のための別の脂質培地を利用した。 Bicellesは、両親媒性物質（CHAPSO）または短鎖脂質（DHPC）とホスファチジルコリンの脂質（DMPC）をブレンドすることにより形成された脂質/両親媒性物質混合物である。両親媒性分子のラインが無極性のエッジが二重膜と界面活性剤の両方の有益な特性を提供しながら、各bicelleのディスク内に、脂質分子が二重層が生成されます。重要なのは、その転移温度以下に、タンパク質- bicelleの混合物は、還元粘度を持ち、結晶化ロボットとbicellesが互換性を、界面活性剤で可溶化した議員と同様の方法で操作されます。
Bicellesが正常にいくつかの膜タンパク質5,7-11（表1）を結晶化するために使用されている。この成長のコレクション蛋白質の原核生物と真核生物源からのαヘリックスとβシートのMPの両方を結晶化するためのbicellesの汎用性を示しています。なぜなら、これらの成功と高スループットの実装のシンプルさ、bicellesはすべての膜タンパク質の結晶学者の武器庫の一部である必要があります。このビデオでは、我々はbicelle方法論を説明し、標準的なロボットを使用してMPを精製のハイスループット結晶化試験を設定するためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。
Protocol
Discussion
Bicellesは洗剤で可溶化したかのように動作しながら、ネイティブの二重層のような環境を提供するユニークな脂質メディアです。ない学習曲線またはこの技法のために必要な特殊な機器がないので、このプロパティは、bicelles、他の脂質ベースの結晶化の方法に比べて明確な利点を与える。一度bicellesは、商用または実験室で調製されたいずれかの利用可能な、彼らは結晶化の試験がほぼ正確…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、博士に感謝します。 bicelleの方法と有用な議論のための博士テルアビブラパスに技術的な専門知識と指導を提供するためのジェームズボウイとセーラムFaham。我々は実験的にサポートするようにルデュを認めます。 Rachna Ujwalしかし、この作業をサポートしていない、MemXバイオサイエンスLLC、の経済的利害関係を持っています。この作品は、NIH（RO1 GM078844）からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
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