High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode
Summary
Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine (MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung, die Einrichtung von Kristallisationen Studien (sowohl manuell als auch maschinell) und Ernte-Kristalle aus dem Medium.
Abstract
Membranproteine (MPs) spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen wie Pumpen spezifische Moleküle durch die ansonsten undurchlässige Membran-Doppelschicht, dass alle Zellen und Organellen umgibt. Änderungen in der Funktion des Abgeordneten führen in vielen menschlichen Krankheiten und Störungen, daher bleibt ein komplexes Verständnis ihrer Strukturen eine entscheidende Ziel für die biologische Forschung. Allerdings bleibt die Strukturbestimmung der Abgeordneten eine große Herausforderung oft aus ihrer Hydrophobizität.
Abgeordnete haben erhebliche hydrophobe Regionen innerhalb der Doppelschicht eingebettet. Reinigungsmittel werden häufig verwendet, um diese Proteine aus der Doppelschicht erzeugt ein Protein-Detergenz Mizellen, die dann in ähnlicher Weise als lösliche Proteine manipuliert werden können aufzulösen. Traditionell gehen Kristallisation Studien mit einem Protein-Waschmittel-Gemisch, aber oft widerstehen Kristallisation oder erzeugen Kristalle von schlechter Qualität. Diese Probleme entstehen aufgrund derReinigungsmittel in der Lage ist, angemessen imitieren die Doppelschicht zu einer schlechten Stabilität und Heterogenität. Darüber hinaus das Waschmittel schirmt die hydrophobe Oberfläche des MP Reduzierung der Fläche für Kristall-Kontakte. Zur Umgehung dieser Nachteile Abgeordnete kann in Lipid-Medien, die eine bessere Simulation ihrer endogenen Umgebung kristallisiert werden, und hat vor kurzem zu einem de novo-Technik für MP Kristallisation.
Lipidische kubische Phase (LCP) ist ein dreidimensionales Lipiddoppelschicht durch ein vernetztes System von wässrigen Kanäle 1 eingedrungen. Obwohl Monoolein ist das Lipid der Wahl haben Lipide wie monopalmitolein und monovaccenin auch genutzt, um LCP 2 zu machen. Abgeordnete werden in das LCP, wo sie in drei Dimensionen und Futtermitteln Kristallkeime diffuse eingearbeitet. Ein großer Vorteil des LCP ist, dass das Protein in einer nativen Umgebung bleibt, aber die Methode hat eine Reihe von technischen Nachteilen einschließlich High viscosity (erfordert spezialisierte Einrichtungen) und Schwierigkeiten bei der Kristall-Visualisierung und Manipulation 3,4. Aufgrund dieser technischen Schwierigkeiten, verwendeten wir eine andere Lipid-Medium für die Kristallisation-Bicellen 5,6 (Abbildung 1). Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen hergestellt, indem ein Phosphatidylcholin Lipid (DMPC) mit einem Amphiphil (CHAPSO) oder eine kurzkettige Lipid (DHPC) gebildet. Innerhalb der einzelnen Bicellen Disc erzeugen die Lipid-Moleküle eine Doppelschicht, während die amphiphile Moleküle Linie der apolaren Ecken für eine vorteilhafte Eigenschaften der beiden Doppelschichten und Waschmittel. Wichtig ist, dass unter ihrer Sprungtemperatur haben Protein-Bicellen Mischungen eine reduzierte Viskosität und sind in einer ähnlichen Weise wie Waschmittel-solubilisierten Abgeordnete manipuliert, so dass Bicellen kompatibel mit Kristallisation Roboter.
Bicellen wurden erfolgreich eingesetzt, um kristallisieren verschiedene Membranproteine 5,7-11 (Tabelle 1). Diese wachsende Sammlungvon Proteinen demonstriert die Vielseitigkeit des Bicellen zur Kristallisation sowohl alpha Helix und beta-Faltblatt Abgeordneten aus prokaryotischen und eukaryotischen Quellen. Aufgrund dieser Erfolge und der Einfachheit der High-Throughput-Umsetzung sollte Bicellen Bestandteil jedes Membranprotein Kristallographen Arsenal sein. In diesem Video beschreiben wir die Bicellen Methodik und bieten eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Aufbau High-Throughput-Kristallisation Studien von gereinigtem MPs mit Standard-Robotik.
Protocol
Discussion
Bicellen sind eine einzigartige Lipid-Medien, die eine native Doppelschicht-ähnliche Umgebung bieten und gleichzeitig verhalten, als ob durch Detergenzien solubilisiert. Diese Eigenschaft verleiht Bicellen einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Lipid-basierte Kristallisationsverfahren, da es keine Lernkurve oder spezielle Geräte für diese Technik erforderlich. Sobald Bicellen verfügbar sind, weder zu kommerziellen oder vorbereitet in das Labor, können sie direkt gemischt mit gereinigtem Protein und von die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Drs danken. James Bowie und Salem Faham für die technische Expertise und Beratung über die Bicellen Methode und Dr. Aviv Paz für hilfreiche Diskussionen. Wir erkennen Le Du für experimentelle Unterstützung. Rachna Ujwal hat finanzielles Interesse an MemX Biosciences LLC, die jedoch nicht unterstützen diese Arbeit. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der NIH (RO1 GM078844) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
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