إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني
Summary
ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.
Abstract
خرائط مصير، التي شيدت من النسب تتبع كافة الخلايا من الجنين، التي تكشف الأنسجة ينزل من كل خلية من خلايا الجنين. على الرغم من أن مصير خرائط مفيدة جدا لتحديد السلائف من جهاز لتوضيح والمسار التنموي الذي الخلايا سليل ملء هذا الجهاز في الجنين الطبيعي، فإنها لا توضح الإمكانات الكاملة التنموية للخلية السلائف أو تحديد الآليات التي يتم تحديد مصيرها. لاختبار التزام مصير الخلية، واحدة يقارن مرجع الخلية العادية من أصل أفريقي في الجنين سليمة (خريطة مصير) مع الآراء التي أعرب بعد التلاعب التجريبية. ومصير الخلية ثابتة (الملتزم) بغض النظر عن البيئة المحيطة الخلوية، أم أنها تتأثر بعوامل خارجية المقدمة من جيرانها؟ باستخدام خرائط شاملة مصير الجنين القيطم، ونحن تصف كيفية تحديد وعزل ودعا ثقافة الانقسام المرحلة السلائف واحد، الأرومةمرس. هذا النهج يسمح احد لتقييم ما إذا كانت تلتزم هذه الخلايا في وقت مبكر لمصير يكتسبون في بيئتها الطبيعية في الجنين سليمة، يتطلب التفاعل مع الخلايا المجاورة لها، أو يمكن أن تتأثر للتعبير عن مصائر بديلة إذا تعرضت إلى أنواع أخرى من الإشارات.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع المورق القيطم الأجنة للتعرف على الآليات التي الخلايا الجنينية الحصول على مصائرهم محددة لبيضها هي كبيرة بما يكفي للسماح النهج المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تضع خارجيا دون الحاجة للمكملات الغذائية للثقافة المتوسط لأن كل خلية تحتوي على إمدادات الغنية داخل الخلايا الصفائح الدموية صفار التي توفر مخزن الطاقة الذاتية. رصيدا هاما لدراسة الآليات التي يتم تحديد مصير الخلية هي مجموعة شاملة من خرائط مصير blastomeres مرحلة الانقسام (من 2 – من خلال 32-الخلية مراحل) 1، 2، 3، 4، 5، 6. تم بناء هذه الخرائط من قبل microinjecting جزيء كشف في قسيم أرومي، واحدة للتحديد ورصد في وقت لاحق في التنمية التي يتم ملؤها من قبل الأنسجة ذرية المسمى. خرائط مصير يتفق ممكنة لأنه لا يمكن للمحاور الأساسية للأجنة التي تم تحديدها بشكل صحيح في كثير من امبرينظام التشغيل. أولا، في جميع الأجنة النوع البري نصف الكرة الحيوان مصطبغة، في حين أن نصف الكرة نباتية ليست كذلك. ثانيا، دخول الحيوانات المنوية في الإخصاب يسبب انكماش للحيوان تصبغ نصف الكرة نحو الجانب البطني في المستقبل؛ في الأجنة العديد من الفرق تصبغ بالتالي يمكن استخدامها للتمييز بين الجانبين الظهرية والبطنية. ثالثا، ثلم الانقسام يقارب 1 يمكن استخدام الطائرة منتصف السهمي في معظم الأجنة، وبالتالي لتحديد الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. الخرائط مصير تعتمد أيضا على حقيقة أن البيض المخصب بشكل طبيعي في كثير من الأحيان يلتصق في أنماط منتظمة التي تجعل كل قسيم أرومي التعرف عبر عدد كبير من الأجنة. بينما هناك تفاوتا داخل وبين براثن البيض والانقسام بشأن تصبغ أنماط، وذلك باستخدام إجراءات الاختيار وصف يسمح هنا الكشف عن هويته الخلايا مع مصائر المقررة بدقة حوالي 90٪.
يمكن أن مصير الخلايا ردعالملغومة خلال مرحلة التطور الجنيني من عدة آليات. العوامل الذاتية، مثل mRNAs وحشوية ورثت تفاضلي أو البروتينات، والمساهمة في العديد من جوانب الزخرفة في وقت مبكر. على سبيل المثال، mRNAs والأمهات محددة تحديد الخلايا التي ستسهم في خط الجرثومية، تصبح الأديم الباطن، أو المساهمة في محور الجسم الظهرية (في تاريخ 7). عوامل خارجي المقدمة محليا من قبل الخلايا المجاورة أو أكثر بعيدة من مركز إشارات الجنينية، هي المسؤولة عن إحداث أنواع الأنسجة محددة والزخرفة تقريبا كل نظام الجهاز. أمثلة على مراكز يشير تشمل المنظم / عقدة في المعيدة أن الحث على الأديم الظاهر العصبي وأنماط الطبقة الجرثومية الوسطى، ومنطقة استقطاب نشاط أنماط المحور الأمامي الخلفي من برعم الطرف. على الرغم من أن خرائط تحديد مصير السلائف من مختلف الأجهزة والكشف عن المسار التنموي الذي اتخذته أولادهم في الجنين الطبيعي، فإنها لا يمكن التمييز بين الذاتيةوالتأثيرات الخارجية على تلك الخلايا. كما أنها لا تكشف عن الإمكانات الكاملة التنموية للخلية، التي تفرق أحفاد في بيئة معقدة من الإشارات الجنين. يمكن نهجين التجريبية اختبار ما إذا كان يتم تحديد مصير الخلية من العوامل الجوهرية أو يتأثر لاحقا من قبل العوامل الخارجية: 1) زرع الخلية إلى موقع الرواية في الجنين، أو 2) إزالة الخلايا من الجنين تليها الثقافة في غياب إشارات خارجية.
وكانت كلا النهجين التجريبية الممكنة في القيطم لأن الخلايا هي كبيرة بما يكفي ليمكن فصلها يدويا. على سبيل المثال، قد حذفت العديد من الدراسات الخلايا من أجنة واحدة (لتغيير خلية خلية التفاعلات) أو الخلايا المزروعة إلى مواقع جديدة في الأجنة المضيفة لاختبار التغييرات مصير (مراجعة في 7 و 8 و 9). وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج الثاني من شرحا أعداد صغيرة من الخلايا من مناطق مختلفة من الجنين أناn لثقافة لتوضيح التفاعلات الأنسجة الاستقرائي في غياب عوامل خارجية ممكن لأن تمتلئ خلايا الجنين القيطم مع تخزين المواد الغذائية داخل الخلايا والصفائح الدموية صفار. ولذلك، يمكن تربيتها أنها لبضعة أيام في المتوسط دون تعريف الملح مكملات الغذائية أو عامل نمو ثقافة المتوسط. وقد استخدمنا هذا النهج لإظهار أن blastomeres الحيوان الظهرية لديها قدرة مستقلة لإنتاج الأنسجة العصبية أرومية متوسطة والظهرية بسبب mRNAs ورثت أمهات 10 و 11، وغيرها أظهرت أن مواصفات الأديم المتوسط من 32 خلية blastomeres تعتمد على كل من المعلومات الجوهرية وخارجي 12 . ميزة زراعة الخلايا كما هو إإكسبلنتس التي يمكن أيضا أن تستكمل المتوسطة مع عوامل محددة لتحديد أي إشارة الخلية الى خلية الاتصال مسار قد تؤثر على مصير الخلية explanted 12 و 13 و 14. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن حقن العلاقات العامة قسيم أروميIOR للثقافة مع مرنا لجين لأكثر من صريحة، أو مع مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] لمنع ترجمة mRNAs والمحلية. يمكن لهذه، وزيادة والخسائر من الوظائف التحليلات التي تتطلب تحديد جزيئات لمصير أعرب مستقل. لتحليل مصير يزدرع، يمكن إجراء تحديد أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير الجيني القياسي (على سبيل المثال، في الموقع التهجين، RT-PCR) والمقايسات immunocytochemical. هذا البروتوكول يوفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة للتمييز بين آليات الجوهرية وخارجي التي تنظم كيفية خلية جنينية تطور الى أنسجة معينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لزراعة ناجحة لblastomeres الفردية هي: 1) تحديد بشكل صحيح قسيم أرومي المصالح؛ 2) الحفاظ على معقمة، والثقافة الصحية؛ 3) خلايا تشريح في الجزء الصحيح من دورة الخلية، و4) تطوير دليل الضرورية البراعة لمنع الضرر خلال تشريح ونقل إلى الثقافة أيضا.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه هارلان GWU زمالة لدعم المنح وPaaqua لوثر رايس GWU زمالة لدعم هيرولد منى. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة MCB-1121711.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
