Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Summary

Судьба отдельных эмбриональные клетки может быть под влиянием унаследованного молекул и / или сигналов от соседних клеток. Используя судьба карты расщепления зародыше Xenopus, одной бластомеры могут быть определены для культуры в изоляции для оценки вклада наследственных молекул по сравнению с межклеточных взаимодействий.

Abstract

Судьба карт, построенных по линии отслеживания всех клеток эмбриона, выявить, какие ткани происходят от каждой клетки эмбриона. Хотя судьба карт очень полезны для выявления предвестников органа и для выяснения развитии путь, по которому потомки клеток заполнения этого органа в нормальном эмбрионе, они не иллюстрируют полное развитие потенциала клеток-предшественников или определить механизмы, с помощью которых его судьба определяется. Для проверки ячейки обязательства судьбы, сравнить нормального репертуара клетки потомков в интактных эмбрионов (судьба карте) с теми, выраженное после экспериментальных манипуляций. Это судьба ячейки фиксированной (совершенные) независимо от окружающей среды сотовый, или это зависит от внешних факторов, предоставленных его соседей? Используя подробные карты судьбы эмбрионов Xenopus, мы расскажем, как выявление, изоляция и культуре одного прекурсоров стадии дробления, называют BlastoМерес. Такой подход позволяет оценить, являются ли эти ранние клетки полны решимости судьбы они приобретают в их обычной среде в неповрежденной эмбриона, требующих взаимодействия с соседними клетками, или можно влиять, чтобы выразить альтернативные судьбы при соприкосновении с другими типами сигналов.

Introduction

Xenopus Хепориз эмбрионов были использованы широко определить механизмы, с помощью которых эмбриональные клетки приобретают их конкретными судьбами, потому что их яйца являются достаточно большими, чтобы позволить микрохирургического подхода. Кроме того, они развиваются внешне без необходимости использования пищевых добавок в культуральной среде, потому что каждая клетка содержит богатый внутриклеточного питания тромбоцитов желток, которые обеспечивают внутренний запас энергии. Важным преимуществом для изучения механизмов, посредством которых клетки судьбу определяют это полный набор карт судьбы бластомеров на стадии дробления (от 2 – до 32-клеточной стадии) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Эти карты были построены microinjecting обнаружены молекулы в одну, идентифицируемые бластомеров и контроль позднее в развитие которого тканей населенных меченых потомства. В соответствии Карты судьбы возможны, потому что кардинальных осей эмбрионы могут быть надежно выявлены во многих ЭмбриОС. Во-первых, во всех эмбрионов дикого типа животных полушария пигментированные, в то время вегетативного полушария не является. Во-вторых, вступление сперма при оплодотворении вызывает сокращение пигментации животных полушария в будущее брюшной стороны, во многих эмбрионов пигментации разницы, следовательно, может быть использована для различия между спинной и брюшной сторон. В-третьих, первой борозды дробления приближается к середине сагиттальной плоскости в большинстве эмбрионов, и, следовательно, может быть использована для определения правой и левой сторон эмбриона. Судьба карты также рассчитывать на то, что, естественно оплодотворенные яйца часто расщепляют в закономерности, которые делают каждого бластомеров идентифицируемые по большому населения эмбрионов. В то время как изменчивость внутри и между кладки яиц в отношении пигментации и расщепление моделей, с использованием процедур отбора, описанные здесь позволяет клеткам с заданными судьбы должны быть определены с 90% точностью.

Сотовые судьбы может быть определенадобываются во время эмбриогенеза несколько механизмов. Внутренние факторы, такие как дифференциально унаследовал цитоплазматических мРНК или белков, способствуют некоторые аспекты раннего паттерна. Например, конкретных материнских мРНК определить, какие клетки будут способствовать зародышевой линии, становятся энтодермы, или вклад в спинной оси тела (обзор ^7). Внешние факторы при условии, локально соседними клетками или более отдаленно от центра эмбриональных сигнализации, несут ответственность за склонение конкретные типы тканей и структурирование почти каждый орган системы. Примеры сигнализации центры включают в себя организатором / узел в гаструлы, что вызывает нервные эктодермы и мезодермы моделей, и в зоне поляризующей активности, что модели передне-задней оси конечности почки. Хотя судьба карты выявления предвестников различных органов и выявить пути развития, принятых их потомков в нормальный эмбрион, они не могут различать внутреннююи внешние воздействия на эти клетки. Они также не раскрывают полный потенциал развития клетки, чьи потомки дифференцироваться в комплексе сигнальную среду эмбриона. Два экспериментальных подходов можете проверить судьбу клетки определяется внутренним факторам или в дальнейшем под влиянием внешних факторов: 1) трансплантации клетки к новому расположению в зародыше, или 2) удаление клеток из эмбрионов последующей культуры в отсутствие экзогенных сигналов.

Оба экспериментальных подходов было возможно в Xenopus, потому что клетки являются достаточно большими, чтобы вручную разделить. Например, многочисленные исследования были удалены отдельные клетки из эмбрионов (для изменения межклеточных взаимодействий) или пересаженных клеток к новым мест в принимающих эмбрионы, чтобы проверить на судьбу изменения (обзор в ^{7, 8, 9).} Кроме того, второй подход культивирующий в искусственной среде небольшого числа клеток из различных регионов эмбриона яNto культуры выяснить индуктивных взаимодействий ткани в отсутствие внешних факторов, возможно потому, что клетки эмбрионов Xenopus заполнены внутриклеточных питательных магазине, желток тромбоцитов. Таким образом, они могут быть культивировали в течение нескольких дней в определенный солевой среде без питания или добавок фактор роста питательной среды. Мы использовали этот подход, чтобы показать, что спинной бластомеров животных имеют автономную способность производить нервные и спинного мезодермальных тканей из-за наследуется по материнской мРНК, ^{10, 11,} и другие показали, что мезодерма спецификации 32-клетки бластомеры зависит как от внутренней и внешней информации ¹² . Преимущество культивирования клеток в качестве эксплантов в том, что среда также может быть дополнен с определенными факторами сигнализации чтобы определить, какие клетки к клетке канал связи может повлиять на судьбу эксплантированных ячейки ^{12, 13, 14.} Кроме того, можно вводить бластомеров пр.IOR к культуре с мРНК более-экспресс ген, или с антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы предотвратить перевод эндогенной мРНК. Эти, усиления и потерей функции анализа можно определить, какие молекулы, необходимые для автономного выразил судьба. Для анализа судьбы эксплантов, выявление специфических типов клеток может быть выполнена стандартная экспрессии генов (например, в гибридизация, RT-PCR) и иммуноцитохимических анализов. Этот протокол обеспечивает простой, но мощный, способ различать внутренние и внешние механизмы, которые регулируют как эмбриональная клетка развивается в определенных тканях.

Protocol

1. Подготовка инструментов, культура, СМИ и посуда Резкость четыре щипцы использованием глинозема абразивной пленкой. Делайте это под рассекает микроскопом, чтобы контролировать размер чаевых. Одна пара щипцов служит в качестве резервного в случае, если наконечник поврежден во в…

Representative Results

Способность этого анализа, чтобы точно оценить потенциал развития клетки опирается на рассекающих из правильных бластомеров основан на судьбе 1 карт, 2, 3, 4, 5, 6. Поэтому, очень важно выбрать эмбрионов с правильной картины пигментации на 2-клеточной стадии, как показано на рисун?…

Discussion

Наиболее важных шагов для успешного культивирования отдельных бластомеров являются: 1) правильность определения бластомеров интересов; 2) поддержание стерильной, здоровой культуры, 3) рассекает клеток при правильной частью клеточного цикла и 4) разработку необходимых руководства ловк?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use