Espianti blastomero al test per l'Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Summary

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Abstract

Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell'embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell'organo nell'embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l'impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell'embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E 'il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall'ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell'embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell'embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.

Introduction

Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 – a 32 celle stadi) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Queste mappe sono state costruite da una molecola microinjecting rilevabile in un unico, blastomero identificabile e il monitoraggio in seguito allo sviluppo che i tessuti sono popolate dalla progenie etichetta. Mappe destino consistenti sono possibili perché gli assi cardinali degli embrioni possono essere identificati in molti Embryos. In primo luogo, tutti gli embrioni wild type l'emisfero animale è pigmentata, mentre l'emisfero vegetale non lo è. Secondo, l'ingresso dello spermatozoo nella fecondazione provoca una contrazione della pigmentazione animale emisfero verso il lato ventrale futuro, in molti embrioni una differenza pigmentazione pertanto possono essere utilizzati per discriminare i lati dorsale e ventrale. Terzo, il solco prima segmentazione approssima il piano sagittale nella maggior embrioni, e quindi può essere utilizzato per identificare i lati destro e sinistro del embrione. Le mappe destino si basano anche sul fatto che naturalmente fecondato le uova frequentemente aderire nella schemi regolari che rendono ogni blastomero identificabile attraverso una vasta popolazione di embrioni. Mentre non vi è variabilità all'interno e tra le grinfie di uova in materia di modelli di pigmentazione e scissione, con procedure di selezione descritte nel presente documento consente di cellule con destini prescritti da identificare con circa il 90% di accuratezza.

Destini cellulari possono essere dissuadereestratto durante l'embriogenesi da diversi meccanismi. I fattori intrinseci, come differenzialmente ereditati mRNA citoplasmatici o proteine, contribuiscono a diversi aspetti di patterning precoce. Ad esempio, specifici mRNA materni determinare le celle contribuirà alla linea germinale, diventare il endoderma, o contribuire all'asse dorsale del corpo (recensione in ^7). I fattori estrinseci forniti a livello locale da parte delle cellule vicine o più distanti da un centro embrionale di segnalazione, sono responsabili di indurre specifici tipi di tessuto ed il modello quasi ogni organo del sistema. Esempi di centri di segnalazione comprendono l'organizzatore / nodo nella gastrula che induce ectoderma neurale e il mesoderma modelli, e la zona di attività polarizzante che il pattern asse anteriore-posteriore del germoglio dell'arto. Sebbene le mappe destino identificare i precursori dei diversi organi e rivelano il percorso di sviluppo adottate dai propri discendenti in embrione normale, non in grado di distinguere tra intrinsecae le influenze estrinseche su tali cellule. Inoltre, non rivelano il potenziale di sviluppo di una cella, i cui discendenti differenziare in un ambiente complesso di segnalazione dell'embrione. Due approcci sperimentali può verificare se il destino di una cellula è determinata da fattori intrinseci o successivamente viene influenzata da fattori esterni: 1) trapianto di cellule in una posizione romanzo nell'embrione, o 2) la rimozione della cellula dall'embrione seguita da coltura in assenza di segnali esogeni.

Entrambi gli approcci sperimentali sono realizzabili in Xenopus perché le cellule sono abbastanza grandi da essere separati manualmente. Per esempio, numerosi studi hanno cancellato singole cellule da embrioni (per cambiare interazioni cellula-cellula) o le cellule trapiantate a posizioni nuove in embrioni di accoglienza per verificare i cambiamenti destino (recensione in ^{7, 8, 9).} Inoltre, il secondo approccio di espianto piccolo numero di cellule provenienti da diverse regioni dell'embrione icultura nto di chiarire le interazioni tissutali induttivi in assenza di fattori esogeni è possibile perché le cellule dell'embrione Xenopus sono riempiti con un archivio intracellulare dei nutrienti, le piastrine tuorlo. Pertanto, essi possono essere coltivate per alcuni giorni in un mezzo definito sale senza integrazione nutrizionale o fattore di crescita del mezzo di coltura. Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che blastomeri animali dorsali hanno una capacità autonoma di produrre tessuti mesodermiche neurali e dorsale a causa di ereditarietà materna mRNA ^{10, 11,} e altri hanno dimostrato che le specifiche mesoderma di 32 cellule blastomeri si basa su informazioni sia intrinseco ed estrinseco ¹² . Un vantaggio di coltura di cellule come espianti è che il mezzo può anche essere integrato con segnalazione definiti fattori per determinare quale cellula-cellula percorso di comunicazione potrebbe influenzare il destino della cellula espiantato ^{12, 13, 14.} Inoltre, si può iniettare la pr blastomeroior alla cultura con mRNA a un eccesso di esprimere un gene, o con oligonucleotidi anti-senso per evitare la traduzione di mRNA endogeni. Questi, guadagno e perdita di funzione di analisi in grado di identificare le molecole che sono necessarie per un destino autonomamente espressa. Per analizzare il destino della espianto, identificazione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite da espressione genica standard (ad esempio, ibridazione in situ, RT-PCR) e saggi di immunocitochimica. Questo protocollo fornisce un semplice, ma potente, modo di distinguere tra i meccanismi intrinseci ed estrinseci che regolano una cellula embrionale si sviluppa nei tessuti specifici.

Protocol

1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile. Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS],…

Representative Results

La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe 1, 2, 3, 4, 5, 6. Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono al…

Discussion

Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene.

Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrio…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use