Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Summary

Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.

Abstract

Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.

Introduction

Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose ^1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor opname en microbiële assimilatie zorgt katalyseren. Het enzym fosfatase releases oplosbare anorganische fosfaatgroepen van organofosfaten, wezen mineralisatie van fosfaat en beschikbaar te maken voor gebruik door de meeste organismen ^3. Andere enzymen, zoals N-acetylglucosaminidase (NAGase) zijn important in chitine degradatie en kan zowel koolstof en stikstof beschikbaar voor microbiële overname ⁴ maken.

Een van de procedures voor de bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in de natuur is het gebruik van kunstmatige p-nitrofenyl (p NP) verbonden substraten, een benadering die oorspronkelijk werd ontwikkeld bodem fosfataseactiviteit ⁵ detecteren. Deze benadering berust op de detectie van een gekleurd eindproduct, p-nitrofenol, dat vrijkomt wanneer de kunstmatig substraat wordt gehydrolyseerd door het geschikte enzym. De p-nitrofenol kan vervolgens colorimetrisch gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij ongeveer 400-410 nm. Deze methode is vervolgens toegepast op andere enzymen zoals NAGase ⁶ detecteren, en is gebruikt in verschillende onderzoeken naar microbiële extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten ^7-9.

Een alternatieve benadering die originall wasy ontwikkeld om extracellulaire glucosidasewerkzaamheid beoordelen in het aquatisch milieu ^10,11 maakt gebruik van 4-methylumbelliferon (MUB) gekoppeld substraten. Het eindproduct uitgebracht (4-methylumbelliferon) is sterk fluorescerende en kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorometer met een excitatie / emissie instelling rond 360/460 nm. Diverse MUB-gekoppelde kunstmatige substraten zijn, waardoor de fluorometrische meting van de activiteit van ten minste evenveel enzymen (bijv. β-glucosidase, cellobiohydrolase, NAGase, fosfatase) zoals kan worden bepaald met de p NP-substraat colorimetrische werkwijze. Andere microbiële extracellulaire enzymen, zoals eiwit-afbrekende leucine aminopeptidase kan fluorometrisch worden getest met 7-amino-4-methylcumarine (COU) verbonden substraten. Zowel MUB-en COU-gekoppelde substraten zijn gebruikt om enzymactiviteit te bepalen in verschillende terrestrische en aquatische monsters ^12,13.

Hoewel eerdere studies hebben descrIBED fluorometrische of colorimetrische microplaat benaderingen van extracellulaire enzymactiviteit ¹⁴ te bepalen, er is behoefte aan een duidelijke presentatie van hoe dergelijke tests uit te voeren. Hier laten we procedures voor de high throughput microplaat voor de analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substraten benadering en in natuurlijk water via de fluorescente MUB verbonden substraten techniek. Wij richten ons op de meting van de activiteiten van β-glucosidase, NAGase en fosfatase als deze enzymen respectievelijk kunnen worden gekoppeld aan koolstof, stikstof en fosfor fietsen. Echter, de hier beschreven procedures voor bepaling van andere extracellulaire enzymen met verschillende artificiële substraten.

Protocol

Colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten 1. Voorbereiding van de ondergrond en Buffer oplossingen voor Colorimetric Analyses enzymactiviteit Bereid 50 mM acetaatbuffer (pH 5,0-5,5) door mengen van 50 ml 0,1 M azijnzuur (2,87 ml ijsazijn op in 500 ml water), 150 ml 0,1 M natriumacetaat en 200 ml gedestilleerd H2O Breng de pH op 5,0-5,5 met 0,1 M azijnzuur indien nodig. Bereid een oplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) …

Representative Results

Bodems en waterbodems hebben meestal aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van de bijgevoegde microbiële gemeenschappen (biofilms) groeien op het oppervlak van deeltjes. Figuur 3 toont hoe deze activiteit is afhankelijk van de grootte van de deeltjes verkregen bij het ​​oppervlak sediment van een derde orderstroom in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen sedimentpartikels van deze stroom kan worden gesch…

Discussion

Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking ¹⁷ verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters d…

Materials

			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers