Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi
Summary
Procedure su micropiastra sono descritte per l'analisi colorimetrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.
Abstract
Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l'attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell'attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell'ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l'analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l'attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.
Introduction
Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all'unisono per catalizzare l'idrolisi di cellulosa in glucosio 1,2, che fornisce un substrato di carbonio utilizzabile per l'assorbimento e l'assimilazione microbica. L'enzima fosfatasi rilascia gruppi fosfati inorganici solubili da organofosfati, essenzialmente mineralizzanti fosfato e renderlo disponibile per l'uso da maggior parte degli organismi 3. Altri enzimi, come N-acetilglucosaminidasi (NAGase), sono important in degrado chitina e può fare sia il carbonio e l'azoto disponibile per acquisizione microbica 4.
Una delle procedure per il saggio di attività enzimatica extracellulare microbica in ambienti naturali è l'uso di p-nitrofenil artificiale (p NP) substrati collegati, un approccio che è stato originariamente sviluppato per rilevare l'attività della fosfatasi terreno 5. Questo approccio si basa sul rilevamento di un prodotto finale colorato, p-nitrofenolo, che viene rilasciato quando il substrato artificiale viene idrolizzato dall'enzima appropriato. Il p-nitrofenolo può essere successivamente quantificato colorimetro misurando la sua assorbanza a circa 400-410 nm. Questo metodo è stato poi applicato a rilevare altri enzimi come NAGase 6, ed è stato utilizzato in vari studi guardando microbica attività enzimatica extracellulare in terreni e sedimenti 7-9.
Un approccio alternativo che era originally sviluppato per valutare l'attività glucosidasi extracellulare in ambienti acquatici 10,11 fa uso di 4-metilumbelliferone (MUB) substrati collegati. Il prodotto finale rilasciato (4-metilumbelliferone) è altamente fluorescente e può essere rilevato utilizzando un fluorimetro con un'impostazione eccitazione / emissione intorno a 360/460 nm. Una varietà di substrati artificiali MUB-legati sono disponibili, permettendo la misurazione fluorimetrica dell'attività di almeno tanti enzimi (ad esempio β-glucosidasi, cellobioidrolasi, Nagase, fosfatasi) come può essere dosati utilizzando la procedura colorimetrica p NP-substrato. Altri enzimi extracellulari microbici, quali la leucina aminopeptidasi proteina-degradanti, possono essere dosati fluorometrically usando 7-ammino-4-metil (COU) substrati collegati. Sia MUB-e substrati COU-legati sono stati utilizzati per determinare l'attività enzimatica in vari campioni terrestri e acquatici 12,13.
Mentre gli studi precedenti hanno described micropiastra fluorometrico o colorimetrico approcci per determinare l'attività enzimatica extracellulare 14, c'è la necessità di una chiara presentazione di come condurre tali analisi. Qui mostriamo le procedure per lo svolgimento di tecniche ad alta velocità micropiastra per l'analisi dell'attività enzimatica extracellulare in suoli e sedimenti che utilizzano l'approccio substrati NP-linked p colorimetrica e nelle acque naturali, utilizzando la tecnica di fluorescenza substrati MUB-linked. Ci concentriamo sulla misurazione delle attività di β-glucosidasi, NAGase, e fosfatasi come questi enzimi possono essere legati al carbonio, azoto, fosforo e ciclismo, rispettivamente. Tuttavia, le procedure qui descritte possono essere applicate alla misurazione di altri enzimi extracellulari usando differenti substrati artificiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica 17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l'attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell'attività enzimatica. Pertanto, a differe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti per gli aspetti di questo lavoro è stato fornito da varie fonti tra cui il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti specifico Accordo Cooperativo 58-6408-1-595 e la National Science Foundation (premio 1.049.911).
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
References
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