Détermination de l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Summary

procédures de microplaques sont décrites pour l'analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l'analyse rapide d'une telle activité dans un grand nombre d'échantillons de l'environnement dans un laps de temps raisonnable.

Abstract

Une grande partie du cycle des éléments nutritifs et la transformation du carbone en milieu naturel se produit grâce à l'activité des enzymes libérées par les micro-organismes extracellulaires. Ainsi, la mesure de l'activité de ces enzymes extracellulaires peut donner un aperçu des taux de processus au niveau de l'écosystème, telles que la décomposition de la matière organique et la minéralisation de l'azote ou du phosphore. Des dosages de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons environnementaux impliquent typiquement l'exposition des échantillons à des substrats colorimétriques ou fluorométriques artificiels et suivant le taux de l'hydrolyse du substrat. Nous décrivons ici microplaques basé méthodes de ces procédures qui permettent l'analyse d'un grand nombre d'échantillons dans un court laps de temps. Les échantillons sont laissés à réagir avec des substrats artificiels à l'intérieur de microplaques de 96 puits ou de puits profond blocs de microplaques, et l'activité enzymatique est ensuite déterminée par absorption ou de fluorescence du produit final résultant de l'utilisation d'un reade microplaque typiquer ou fluorimètre. Ces procédures à haut débit non seulement de faciliter les comparaisons entre les sites ou les écosystèmes séparés spatialement, mais aussi de réduire sensiblement le coût de ces tests en réduisant les volumes globaux de réactifs nécessaires par échantillon.

Introduction

Les micro-organismes tels que les bactéries et les champignons d'obtenir les nutriments et de carbone à partir de composés organiques complexes, grâce à la production d'enzymes extracellulaires. Ces enzymes hydrolysent typiquement des polymères en sous-unités plus petites qui peuvent être prises dans la cellule. Par conséquent, au niveau écologique, ces enzymes extracellulaires microbiennes sont en grande partie responsables de la minéralisation des éléments nutritifs et de la décomposition de la matière organique qui se produit dans les milieux naturels. Des enzymes telles que la cellobiohydrolase (CBH), β-glucosidase et sont importants pour la dégradation de la cellulose et de travail à l'unisson pour catalyser l'hydrolyse de la cellulose en glucose ^1,2, ce qui donne un substrat de carbone utilisables pour l'absorption et l'assimilation microbienne. La phosphatase enzyme libère solubles groupes phosphates inorganiques de organophosphates, essentiellement de minéralisation du phosphate et de la rendre disponible pour une utilisation par la plupart des organismes ^3. D'autres enzymes, telles que la N-acétylglucosaminidase (NAGase), sont important dans la dégradation de la chitine et peut faire à la fois du carbone et de l'azote disponible pour l'acquisition microbienne ^4.

Une des procédures pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux naturels est l'utilisation d'artificiel p-nitrophényl (p NP) des substrats liés, une approche qui a été initialement développé pour détecter sol activité de la phosphatase ^5. Cette approche repose sur la détection d'un produit final coloré, le p-nitrophénol, qui est libéré lorsque le substrat artificiel est hydrolysé par l'enzyme appropriée. Le p-nitrophénol peut ensuite être quantifié par colorimétrie en mesurant son absorbance à environ 400-410 nm. Cette méthode a depuis été appliquée pour détecter d'autres enzymes telles que la NAGase ^6, et a été utilisé dans diverses études portant sur ​​l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les sols et les sédiments ^9.7.

Une approche alternative qui était originally développé pour évaluer l'activité glucosidase extracellulaire dans les milieux aquatiques ^10,11 rend l'utilisation de 4-méthylumbelliférone (IUM) substrats liés. Le produit final libéré (4-méthylumbelliférone) est hautement fluorescent et peut être détectée en utilisant un fluorimètre avec un paramètre d'excitation / émission d'environ 360/460 nm. Une variété de substrats artificiels MUB-liés sont disponibles, permettant la mesure fluorométrique de l'activité d'au moins autant d'enzymes (par exemple β-glucosidase, la cellobiohydrolase, NAGase, phosphatases) que l'on peut doser à l'aide de la procédure colorimétrique de NP-substrat p. D'autres enzymes extracellulaires microbiens, tels que la leucine aminopeptidase de la protéine dégradant, peuvent être analysés par fluorimétrie à l'aide de 7-amino-4-méthylcoumarine (CUO) des substrats liés. Les deux MUB et substrats COU-liés ont été utilisés pour déterminer l'activité enzymatique dans divers échantillons terrestres et aquatiques ^12,13.

Bien que des études antérieures ont descrmicroplaque fluorimétrique ou colorimétrique ibed approches pour déterminer l'activité enzymatique extracellulaire ^14, il ya un besoin pour une présentation claire de la façon de mener de tels essais. Ici, nous démontrons les procédures pour la conduite des techniques à haut débit de microplaques pour l'analyse de l'activité enzymatique extracellulaire dans les sols et les sédiments à l'aide de l'approche colorimétrique p substrats de NP-lié et dans les eaux naturelles en utilisant la technique des substrats MUB-Linked Fluorescent. Nous nous concentrons sur la mesure des activités de β-glucosidase, NAGase, et phosphatase que ces enzymes peuvent être liées au carbone, l'azote et le cycle du phosphore, respectivement. Cependant, les modes opératoires décrits ici peuvent être appliqués à la mesure d'autres enzymes extracellulaires en utilisant différents substrats artificiels.

Protocol

Colorimétrique Analyse des extracellulaire activité enzymatique dans les sols et les sédiments Une. Préparation du substrat et solutions tampons pour les analyses colorimétriques de l'activité enzymatique H préparer tampon acétate 50 mM (pH 5,0 à 5,5), en mélangeant 50 ml de 0,1 M d'acide acétique (2,87 ml d'acide acétique glacial dans 500 ml d'eau), 150 ml de 0,1 M d'acétate de sodium et 200 ml d'eau distillée 2 O. Ajuster le pH à 5,…

Representative Results

Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d'activité enzymatique extracellulaire par suite des communautés microbiennes joints (biofilms) se développant sur ​​la surface des particules. Figure 3 montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules obtenues à partir du sédiment de surface d'une troisième courant de l'ordre dans le nord du Mississippi, États-Unis. Une étude antérieure a montré que les communautés b…

Discussion

Détermination de l'activité d'une variété d'enzymes extracellulaires microbiennes dans les sols et les sédiments peut fournir des indications utiles sur les taux de minéralisation des éléments nutritifs et de matière organique traitement ^17. Cependant, les sols peuvent varier dans leurs niveaux d'humidité, il est donc important de normaliser l'activité de sol poids sec. Cela nécessite une étape de séchage supplémentaire (typiquement de deux jours) au-delà de la simple mesur…

Materials

			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers