的效用舞台专用中旬至下旬<em>果蝇</em>卵泡隔离
Summary
中旬至下旬果蝇卵泡舞台专用的隔离是用于各种用途。这类卵泡发育中培养，其允许基因和/或药理学操作成与体外测定法的开发和实时成像。此外，毛囊，可用于分子生物学研究，如分离mRNA和蛋白。
Abstract
果蝇卵子或卵泡发育已被广泛用于促进复杂的发育和细胞生物学过程的理解。此方法主要介绍如何隔离中期到晚期滤泡（舞台10B-14），并利用它们来提供新的见解时的发育时间紧窗户发生的分子和形态学的事件。分离的毛囊可用于各种实验技术，包括在体外发育分析，实时成像，基因表达分析和蛋白质印迹分析。在卵泡期10B（S10B）或更高版本将完成发展文化，这使得一个基因或药物扰动结合体外发育定义这样的操作对开发过程中的特定时期发生的过程的影响。此外，由于这些卵泡发育，在文化，它们非常适合于实时成像研究，这往往表明调解形态事件的新机制。分离的毛囊也可用于分子分析。例如，在基因表达的变化所导致的遗传扰动可以被定义为特定的发育窗户。此外，在卵泡发育的特定阶段的蛋白质水平，稳定性和/或翻译后修饰状态可以通过蛋白印迹分析检查的分析。因此， 果蝇卵泡阶段特异性的隔离提供了一个丰富 的信息源纳入发展和形态的广泛保守的进程。
Introduction
每个果蝇卵巢由〜16卵巢管，或依次成熟卵室或滤泡链。每个毛囊是由一个单一的卵母细胞，15种系衍生的护士或支持细胞，称为卵泡细胞（ 图1A）〜650体细胞。 果蝇卵子发生划分为14个形态学定义开发1阶段。卵泡发育的各个阶段是在一个苍蝇看到了很多次，使它相对容易隔离的特定阶段的卵泡有相当数量。
卵子发生（阶段10B-14）的中期到晚期是特别适合于隔离阶段（ 图1）。在第一阶段10B（S10B），卵泡完全伸长（ 即其长度等于一个阶段14（S14）卵泡，参见图1和图2H）和毛囊的长度的一半是由护士细胞而另一半是卵母细胞（ 图1C）。在这个阶段，护士细胞发生戏剧性的肌动蛋白重塑，加强皮层肌动蛋白和产生微丝2的平行束。在同一时间，卵泡细胞群，称为心细胞，在迁移护士细胞和卵母细胞之间，和卵泡细胞2背团成为指定接受迁移以形成背侧附属物，管状呼吸装置的胚胎3 。护士细胞，然后合同（S11），其细胞质内容挤进卵母细胞在一个叫护士细胞倾销过程中，它提供了与卵母细胞所必需的因素，它完成胚胎发育（ 图1D）。护士细胞，然后经历细胞死亡（S12-S13）4，和卵泡细胞分泌和图案蛋壳5（ 图1E-G）。因此，卵子发生的到底是富有重要的发展ð形态发生过程。
分离的中期到后期阶段的卵泡（S10B-S14），可以用于各种用途，包括分子分析。例如，mRNA的上演卵泡可以分离用于RT-PCR，微阵列，或RNA定序分析。这使得一看基因表达在短期内发展的窗口，与目前只有少数细胞类型，并确定如何基因表达受任何药物或遗传扰动改变。级分离，也可用于通过Western印迹来看待蛋白质。这种分析是很重要的，因为它允许一个量化蛋白表达水平与野生型相对于在特定阶段的突变体。虽然人们可以使用免疫荧光分析，以达到类似的结果，荧光定量是由于严格的要求，所有的像素被检测6的线性范围内较不稳健。此外，免疫印迹分析可以提供其它信息，例如一个s如果蛋白质被翻译后修饰，或者被从一个特定的剪接同种型表达。分离的阶段，也可以用于进一步的纯化蛋白，包括亚细胞分级或免疫共沉淀。
阶段特异性毛囊分离，也可用于在体外测定法的发展7和实时成像8。隔离S10B-S13卵泡会继续发展到S14在简单的培养基（见下文）。要注意，S10A毛囊不会通过护士细胞进度使用本手稿讨论的培养条件下倾倒是很重要的。我们已经使用S10B 体外发育检测，以确定前列腺素的作用，既药理学和基因，在通过护士细胞倾销与发展为已读奏7,9调节肌动蛋白重塑。同样，开发的后期阶段也可以被分离，以确定药物治疗或基因的人的影响ipulations在特定的过程，如心细胞迁移，背附属物迁移/ 10的形成，和护士细胞死亡。此类测定法可用于执行显性交互屏幕或测定，例如，在杂合子的PXT或中fascin单独突变对S10B 体外发育没有任何效果，从双重杂合子展览护士细胞倾倒缺陷和在发展9块卵泡。
此外，由于S10B-13能在文化发展，都在这段时间发生的过程中，可以通过实时成像观测。这种成像可以简单地使用透射光（如果有一个只关心总的变化形态）或共聚焦显微镜利用转基因果蝇表达的荧光探针或滤泡沾上实时成像染料进行。实时成像被用来大大促进我们的发展过程的理解。事实上，住IMAGIN克的晚期阶段的卵泡不断扩大背侧附属物迁移的知识，小管10的一个例子。我们预计，额外的后期处理，包括护士细胞倾销过程中肌动蛋白动力学，实时成像将提供新的见解这些发育事件。需要注意的是，虽然S10A和卵泡发育的早期阶段就不会继续发展成S14的文化，活在成像过程中发展的阶段发生的事件有可能使用的替代培养条件11-14（见讨论更重要的是信息）。
在这里，我们提供详细的协议进行隔离晚期毛囊无论是在体外发育和生活成像，或分子分析（mRNA和蛋白分离）。
Protocol
Representative Results
Discussion
果蝇卵泡是由只有少数细胞类型，使得它非常适合于形态学和分子分析。此外，由于卵巢的结构，它是比较容易获得大量的卵泡发育的特定阶段的一个共同的解剖范围和最少的培训。由于每个阶段代表一个短的时间窗口，舞台隔离可以提供显著分子见解在那个阶段发生的发育过程。例如，我们使用中期到晚期滤泡隔离表征S10B，S12，和S14 18过程中出现的基因表达的变化。此分析显示…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢托马斯Lecuit（SQH-的utrophin :: GFP线），布卢明顿库存中心，以及发育研究杂交瘤细胞银行试剂。我们还要感谢废话实验室全体成员的稿件有益的讨论和批评。从资助的美国国家科学基金会MCB-1158527，和启动从解剖学和细胞生物学系基金，爱荷华大学支持这项工作。健康博士前培训格兰特在药理科学T32GM067795国家机构支持AJS。数据存储支持通过信息通信技术，它是通过由国家研究资源中心和国家中心推进转化科学，国立卫生研究院，通过格兰特UL1RR024979支持CTSA提供资助。
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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