L'utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em> Drosophila</em> Folliculo Isolation

Summary

L'isolement spécifique du stade de-mi-à la fin de follicules de Drosophila est utile pour une variété de fins. Ces follicules se développent dans la culture, ce qui permet des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour être couplés avec des essais in vitro de développement et de l'imagerie en temps réel. En outre, les follicules peuvent être utilisées pour des études moléculaires, telles que l'isolement de l'ARNm et des protéines.

Abstract

Ovogenèse chez la drosophile ou le développement des follicules a été largement utilisé pour faire avancer la compréhension des processus biologiques de développement et cellulaires complexes. Ce document décrit comment des méthodes pour isoler les follicules de la scène mi-to-fin (étape 10B-14) et de les utiliser pour apporter de nouveaux éclairages sur les événements moléculaires et morphologiques survenant pendant fenêtres étanches de temps de développement. Follicules isolés peuvent être utilisés pour une variété de techniques expérimentales, y compris les essais in vitro de développement, l'imagerie en temps réel, l'analyse de l'expression d'ARNm et l'analyse western blot des protéines. Follicules au stade 10B (S10B) ou plus tard viendront compléter le développement de la culture, ce qui permet de combiner des perturbations génétiques ou pharmacologiques avec le développement in vitro de définir les effets de ces manipulations sur les processus qui se produisent pendant des périodes spécifiques de développement. En outre, parce que ces follicules se développent en culture, elles sont idéales pour les études d'imagerie en direct, Qui révèlent souvent de nouveaux mécanismes qui interviennent dans les événements morphologiques. Follicules isolées peuvent également être utilisées pour les analyses moléculaires. Par exemple, des changements dans l'expression des gènes qui résultent de perturbations génétiques peuvent être définis pour des fenêtres spécifiques du développement. De plus, les taux de protéine, la stabilité et / ou l'état de modification post-traductionnelle de pendant une étape particulière du développement des follicules peuvent être examinées par l'intermédiaire des analyses western blot. Ainsi, l'isolement spécifique au stade de follicules drosophile fournit une riche source d'information dans les processus largement conservées du développement et de la morphogenèse.

Introduction

Chaque ovaire chez la drosophile est composé de ~ 16 ovarioles, ou des chaînes de maturation séquentielle chambres d'oeuf ou de follicules. Chaque follicule est composé d'un seul ovocyte, cellules nourricières ou soutien dérivés 15 lignée germinale, et ~ 650 cellules somatiques appelées cellules folliculaires (figure 1A). Ovogenèse chez la drosophile est divisé en 14 étapes morphologiquement définies de développement ^1. Chaque étape du développement folliculaire est observée plusieurs fois dans une seule volée, ce qui rend relativement facile d'isoler un grand nombre de follicules spécifiques de stade.

Les étapes de l'ovogenèse (Etapes 10B-14) à mi-et la fin sont particulièrement bien adaptés pour l'isolement de l'étape (Figure 1). Au stade 10B (S10B), le follicule est complètement allongée (sa longueur est égale à celle d'une étape 14 (S14) follicule, voir la figure 1 et la figure 2H), et la moitié de la longueur du follicule est composé de cellules nourricièrestandis que l'autre moitié est l'ovocyte (Figure 1C). A ce stade, les cellules nourricières sont soumis dramatique remodelage de l'actine, le renforcement de l'actine corticale et générant des faisceaux parallèles de filaments d'actine ^2. Dans le même temps, une population de cellules de follicules, dite cellules centripètes, de migrer entre les cellules nourricières et l'ovocyte, et deux groupes dorsales des cellules du follicule devient spécifiée à subir une migration pour former les appendices dorsaux, des appareils respiratoires tubulaires pour l'embryon ³ . Les cellules nourricières puis contrat (S11), en serrant leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte dans un processus appelé infirmière cellule dumping, qui fournit l'ovule avec les facteurs nécessaires pour qu'il puisse compléter l'embryogenèse (figure 1D). Les cellules nourricières sont alors soumis à la mort cellulaire (S12-S13) ^4, et les cellules folliculaires sécrètent et modèle la coquille ⁵ (figures 1E-G). Ainsi, la fin de l'ovogenèse est riche avec un développement important ded processus morphogénétiques.

Follicules isolés mi-à fin-scène (S10B-S14) peuvent être utilisés pour une variété de raisons, y compris des analyses moléculaires. Par exemple, l'ARNm à partir de follicules étagés peut être isolée pour la RT-PCR, puces à ADN, l'ARN ou des analyses-seq. Cela permet de regarder l'expression des gènes au sein d'une fenêtre de développement à court, avec seulement quelques types cellulaires présents, et de déterminer comment l'expression des gènes est modifiée par des perturbations soit pharmacologiques ou génétiques. l'isolement de l'étape peut également être utilisé pour étudier des protéines par transfert de Western. Cette analyse est importante car elle permet de quantifier le niveau d'expression de la protéine dans le type sauvage contre des mutants à des stades spécifiques. Alors que l'on pourrait utiliser immunofluorescence analyse pour obtenir des résultats similaires, la quantification de la fluorescence est moins robuste en raison des exigences strictes que tous les pixels se situer dans la plage linéaire de détection ^6. En outre, l'analyse western blot peut fournir d'autres informations, par exemple uns si la protéine est modifiée ou post-traductionnelle est exprimé à partir d'une épissure isoforme spécifique. Étapes isolées peuvent également être utilisées pour une purification supplémentaire de la protéine, y compris fractionnement subcellulaire ou co-immunoprécipitation.

L'isolement du follicule spécifique du stade peut également être utilisé pour des essais in vitro de développement ⁷ et ⁸ d'imagerie en temps réel. Isolés follicules S10B-S13 continueront à se développer à S14 dans les milieux de culture simples (voir ci-dessous). Il est important de noter que les follicules S10A ne seront pas progresser à travers infirmière cellule dumping en utilisant les conditions de culture abordées dans ce manuscrit. Nous avons utilisé S10B dans des essais in vitro de développement de définir le rôle des prostaglandines, à la fois sur le plan pharmacologique et génétique, dans la régulation de l'actine remodelage en utilisant infirmière cellule le dumping et le développement-outs lire ^7,9. De la même façon, les stades ultérieurs de développement peuvent également être isolées pour déterminer les effets des traitements pharmacologiques ou homme génétiqueipulations sur des procédés particuliers tels que la migration centripète de la cellule, la migration dorsale de l'appendice / formation ^10, et l'infirmière la mort cellulaire. Ces tests peuvent être utilisés pour effectuer des écrans d'interaction dominants ou les dosages, par exemple, alors que l'hétérozygotie des mutations dans pxt ou fascine seuls n'ont aucun effet sur ​​S10B développement in vitro, les follicules de doubles hétérozygotes exposition infirmière cellule de dumping défauts et un bloc dans le développement ^9.

En outre, parce S10B-13 peut se développer dans la culture, l'ensemble des processus qui se produisent pendant cette période peut être observé par live-imagerie. Cette image peut être effectuée simplement en utilisant la lumière transmise (si l'on est seulement intéressé par les variations brutes de la morphologie) ou la microscopie confocale en utilisant des mouches transgéniques exprimant des sondes ou des follicules colorées avec des teintures fluorescentes imagerie en direct. Imagerie en temps réel est utilisé pour faire avancer considérablement notre compréhension des processus de développement. En effet, vivre Imaging de follicules à un stade avancé a élargi la connaissance de la migration dorsale de l'appendice, un exemple de tubulogenèse ^10. Nous nous attendons à ce que l'imagerie en direct de processus à un stade avancé supplémentaires, y compris la dynamique de l'actine pendant infirmière cellule de dumping, fournira des informations nouvelles sur ces événements de développement. Il est important de noter que tandis que S10A et les premiers stades du développement du follicule ne va pas continuer à se développer en une S14 dans la culture, en direct-imagerie d'événements survenus au cours de ces stades de développement est possible en utilisant des conditions de culture alternatifs ^11-14 (voir discussion plus d'informations).

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler follicules à un stade avancé de développement, soit in vitro et vivons-imagerie, ou des analyses moléculaires (ARNm et isolement des protéines).

Protocol

Une. Préparation Drosophila avant l'étape d'isolement Faire de la pâte de levure humide en combinant 50 g de levure sèche active avec 90 ml d'eau distillée. Mélanger avec une spatule pour mélanger. Laissez reposer le mélange pendant 30 min ~ avant d'évaluer la cohérence. La consistance doit être juste assez épaisse pour adhérer au côté d'un flacon de volée mais ne fonctionne pas sur le côté. Pour obtenir la consistance désirée, il peut être nécessaire d'a…

Representative Results

Lorsque l'isolement des stades spécifiques du développement folliculaire chez la drosophile, il est essentiel d'être capable de distinguer avec précision les différentes étapes morphologiques. Ceci est quelque peu difficile pour les S10A et S10B, comme les cellules nourricières et l'ovocyte prennent chacun la moitié de la longueur du follicule à ces stades (Figure 1B par rapport à 1C). Cependant, les follicules S10A sont plus courts en longueur que les fol…

Discussion

Le follicule drosophile est composé de seulement un petit nombre de types de cellules, le rendant idéal pour les analyses moléculaires et morphologiques. En outre, en raison de la structure de l'ovaire, il est relativement facile d'obtenir un grand nombre d'étapes spécifiques du développement des follicules avec un microscope à dissection commune et une formation minimale. Comme chaque étape représente une fenêtre temporelle courte, l'isolement de la scène peut fournir des indications…

Materials

Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes – long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018