La utilidad de la etapa específica-Mediados o finales<em> Drosophila</em> Aislamiento folículo

Summary

-Fase específica aislamiento de mediados y finales de los folículos de Drosophila es útil para una variedad de propósitos. Estos folículos se desarrollan en la cultura, lo que permite la manipulación genética y / o farmacológicos a acoplar con los ensayos in vitro de desarrollo en y de imagen en vivo. Además, los folículos se pueden utilizar para los estudios moleculares, tales como el aislamiento de ARNm y proteína.

Abstract

Ovogénesis Drosophila o el desarrollo del folículo ha sido ampliamente utilizado para avanzar en la comprensión de los complejos procesos biológicos celulares y de desarrollo. En este trabajo se describen los métodos de cómo aislar folículos etapa a mediados y finales de la etapa (10B-14) y utilizarlos para proporcionar nuevos conocimientos sobre los fenómenos moleculares y morfológicos que ocurren durante las ventanas cerradas de tiempo de desarrollo. Folículos aislados se pueden utilizar para una variedad de técnicas experimentales, incluyendo los ensayos in vitro en desarrollo, de formación de imágenes en vivo, análisis de la expresión de ARNm y análisis de transferencia Western de proteínas. Los folículos en Etapa 10B (S10B) o posterior completarán el desarrollo de la cultura, lo que permite combinar perturbaciones genéticas o farmacológicas con el desarrollo in vitro para definir los efectos de esas manipulaciones en los procesos que ocurren en períodos específicos del desarrollo. Además, debido a que estos folículos se desarrollan en la cultura, que son ideales para los estudios de imágenes en directo, Que a menudo revelan nuevos mecanismos que median los eventos morfológicos. Folículos aislados también se pueden utilizar para los análisis moleculares. Por ejemplo, los cambios en la expresión génica que resultan de perturbaciones genéticas se pueden definir para ventanas de desarrollo específicas. Además, el nivel de proteína, la estabilidad, y / o estado de modificación postraduccional durante una etapa particular del desarrollo del folículo pueden ser examinados a través de análisis de Western blot. Por lo tanto, el aislamiento de la etapa específica de los folículos de Drosophila proporciona una rica fuente de información en muy conservadas procesos de desarrollo y la morfogénesis.

Introduction

Cada ovario de Drosophila se compone de ~ 16 ovarioles, o cadenas de forma secuencial con vencimiento cámaras de huevos o folículos. Cada folículo se compone de un único ovocito, 15 de la línea germinal derivadas células de la enfermera o de apoyo, y ~ 650 células somáticas denominadas células del folículo (Figura 1A). Drosophila ovogénesis se divide en 14 etapas morfológicamente definidas de desarrollo ^1. Cada etapa de desarrollo del folículo se observa muchas veces dentro de una sola marcha, por lo que es relativamente fácil de aislar un número sustancial de los folículos etapa específica.

Los mediados y finales de etapas de ovogénesis (Etapas 10B-14) son especialmente adecuados para el aislamiento de fase (Figura 1). En la Etapa 10B (S10B), el folículo está totalmente alargada (es decir, su longitud es igual a la de una etapa 14 (S14) folículo, véase la figura 1 y la figura 2H) y media la longitud del folículo se compone de células de la enfermeramientras que la otra mitad es el ovocito (Figura 1C). En esta etapa las células de la enfermera se someten a la remodelación de actina dramática, el fortalecimiento de la actina cortical y la generación de haces paralelos de filamentos de actina ^2. Al mismo tiempo, una población de células del folículo, denominada células centrípetas, migrar entre las células de la enfermera y el ovocito, y dos grupos dorsales de las células del folículo se convierta especificado para someterse a la migración para formar los apéndices dorsales, aparatos respiratorios tubulares para el embrión ³ . Las células de la enfermera después de contrato (S11), apretando sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito en un proceso llamado célula nodriza dumping, que proporciona el ovocito con los factores necesarios para que se complete la embriogénesis (Figura 1D). Las células de la enfermera a continuación, se someten a la muerte celular (S12-S13) ^4, y las células del folículo secretan y el patrón de la cáscara de huevo ⁵ (Figuras 1E-G). Por lo tanto, el final de la ovogénesis es rica con un importante desarrollod procesos morfogenéticos.

Folículos aislados entre mediados y finales de etapa (S10B-S14) se puede utilizar para una variedad de propósitos, incluyendo los análisis moleculares. Por ejemplo, ARNm a partir de folículos por etapas puede ser aislado por RT-PCR, microarrays, o los análisis de ARN-ss. Esto le permite a uno a ver la expresión de genes dentro de una ventana de desarrollo a corto, con sólo unos pocos tipos de células presentes, y determinar cómo la expresión génica se cambia por perturbaciones ya sea farmacológicos o genéticos. Aislamiento etapa también se puede utilizar para analizar las proteínas por Western Blot. Este análisis es importante porque permite cuantificar el nivel de expresión de la proteína de tipo salvaje frente a los mutantes en etapas específicas. Si bien se podría utilizar de inmunofluorescencia analiza para lograr resultados similares, la cuantificación de la fluorescencia es menos robusto debido a los requisitos estrictos que todos los píxeles dentro de la gama lineal de detección ^6. Además, el análisis de transferencia Western puede proporcionar otra información, tals si la proteína se posttranslationally modificado o se expresa a partir de una isoforma de empalme específico. Etapas aisladas también se pueden usar para una mayor purificación de proteínas, incluyendo fraccionamiento subcelular o coimmunoprecipitation.

Aislamiento folículo Etapa específica también puede ser utilizado para los ensayos in vitro en desarrollo ⁷ y en vivo de imágenes ^8. Aislados folículos S10B-S13 continuarán desarrollando a S14 en medios de cultivo sencillo (ver abajo). Es importante tener en cuenta que los folículos S10A no progresar a través de célula nodriza de dumping utilizando las condiciones de cultivo se analizan en este manuscrito. Hemos utilizado en los ensayos in vitro de desarrollo S10B para definir el papel de las prostaglandinas, tanto farmacológica y genética, en la regulación de la remodelación de la actina utilizando células enfermera dumping y el desarrollo como leer-outs ^7,9. Del mismo modo, las etapas posteriores del desarrollo también se pueden aislar para determinar los efectos de los tratamientos farmacológicos o hombre genéticaipulations sobre determinados procesos como la migración centrípeta celular, la migración apéndice dorsal / formación ^10, y la muerte celular enfermera. Tales ensayos pueden ser utilizados para realizar pantallas de interacción dominantes o ensayos, por ejemplo, mientras que la heterocigosidad para mutaciones en PXT o Fascin solos no tienen efecto sobre S10B desarrollo in vitro, los folículos de los heterocigotos dobles célula nodriza de exposiciones de dumping defectos y un bloqueo en el desarrollo ^9.

Además, debido a S10B-13 puede desarrollarse en la cultura, todos los procesos que tienen lugar durante este tiempo se puede observar por las imágenes en vivo. Esta imagen se puede realizar simplemente usando luz transmitida (si uno está interesado sólo en los cambios en la morfología bruto) o con microscopía confocal utilizando moscas transgénicas que expresan las sondas o los folículos teñidas con tintes de imágenes en directo fluorescentes. Formación de imágenes en vivo se utiliza para avanzar sustancialmente nuestra comprensión de los procesos de desarrollo. De hecho, vivir imaging de los folículos en fase tardía se ha ampliado el conocimiento de la migración apéndice dorsal, un ejemplo de tubulogenesis ^10. Esperamos que las imágenes en directo de los procesos finales de etapa adicionales, incluyendo la dinámica de actina durante célula nodriza de dumping, proporcionará nuevos conocimientos sobre estos eventos de desarrollo. Es importante señalar que si bien S10A y las primeras etapas de desarrollo de los folículos no continuarán desarrollando en un S14 en la cultura, en vivo de imágenes de los acontecimientos que ocurren durante esas etapas de desarrollo es posible utilizando condiciones de cultivo alternativos ^11-14 (véase la discusión para más información).

Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar folículos en fase tardía, ya sea para el desarrollo in vitro y vivimos de imágenes, o los análisis moleculares (ARNm y de aislamiento de proteínas).

Protocol

1. Preparación de Drosophila Antes de la etapa de aislamiento Hacer pasta de levadura húmeda combinando 50 g de levadura seca activa con 90 ml de agua destilada. Mezclar con una espátula para mezclar. Dejar reposar la mezcla durante aproximadamente 30 minutos antes de la evaluación de la consistencia. La consistencia debe ser sólo lo suficientemente gruesa como para adherirse a la parte de un vial mosca pero no correr por el lado. Para lograr la consistencia deseada puede ser necesario añadir u…

Representative Results

Cuando el aislamiento de etapas específicas de desarrollo del folículo de Drosophila que es esencial para ser capaz de distinguir con precisión las diferentes etapas morfológicas. Esto es algo difícil para S10A y S10B, como las células de la enfermera y el ovocito cada uno ocupan la mitad de la longitud del folículo en estas etapas (Figura 1B comparó a 1C). Sin embargo, los folículos S10A son más cortos en longitud que los folículos S10B, como los folículos S10B est…

Discussion

El folículo Drosophila se compone de sólo un pequeño número de tipos de células, por lo que es ideal para el estudio morfológico y análisis moleculares. Además, debido a la estructura del ovario, es relativamente fácil de obtener un gran número de etapas específicas de desarrollo del folículo con un microscopio de disección común y una formación mínima. A medida que cada etapa representa una ventana temporal corto, aislamiento etapa puede proporcionar conocimientos moleculares importantes en los…

Materials

Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes – long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018