العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية
Summary
في هذا المنشور، نحن تصف الإجراء السريع ومريحة للعزل وزراعة الخلايا الأولية عنيبي البنكرياس من البنكرياس الفئران. يشكل هذا الأسلوب نهجا قيما لدراسة علم وظائف الأعضاء من خلايا البنكرياس الطازجة الأولية العادي / هو دون تغيير إفرازات.
Abstract
يسمح هذا البروتوكول العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من عنيبات البنكرياس الفئران، مما يجعل من الممكن للحفاظ عليها في الثقافة لمدة أسبوع واحد أو أكثر. ويمكن الحصول على أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية من الفئران واحدة. يوفر هذا البروتوكول إمكانية لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. لأنه يحفظ العمارة عنيبي، وهذا نموذج مناسبة تماما لدراسة علم وظائف الأعضاء من إفرازات البنكرياس في المختبر وعلى النقيض من خطوط الخلايا التي أنشئت من أورام البنكرياس، والذي عرض العديد من التعديلات الوراثية مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كلي للتمايز عنيبي بهم.
Introduction
وثمة مشكلة واجهت كثير من الأحيان لمختبرات البحوث تعمل على أنسجة البنكرياس الإفرازية هو صعوبة زراعة خلايا عنيبية في المختبر لفترة من الزمن طويلة بما فيه الكفاية للسماح لتجربة طويلة الأجل.
أحد العوامل التي تعوق تطوير نظم الاستزراع هذه هي حساسية لا يتجزأ من نسيج البنكرياس للتلاعب التجريبية ويرجع ذلك إلى نسبة عالية في الانزيمات حال السكر، بروتين، دهون و، الذي هضم حرفيا نسيج البنكرياس عندما يتم اطلاق سراحهم خلال عزل خلايا البنكرياس.
والعامل الثاني هو ملحوظ في اللدونة المختبر من خلايا عنيبية، والتي تميل الى فقدان الخصائص الإفرازية وtransdifferentiate إلى الخلايا الناضجة الأخرى، مثل خلايا البنكرياس القنوي أو الخلايا الكبدية، مثل 1. في المختبر، هذه اللدونة الخلية يختلف مع الظروف التجريبية (مثل ثقافة تكوين متوسطة) 2 </سوب> ويدخل على درجة من التعقيد في تصميم الظروف الملائمة لزراعة خلايا البنكرياس الإفرازية 1.
وقد وضعت عدة طرق للعزلة وثقافة من الخلايا عنيبي، أول من خنزير غينيا 3-5 البنكرياس. في البداية، تلك البروتوكولات المعنية هضم أنسجة البنكرياس مع كولاجيناز، كيموتربسين، وكوكتيل البروتيني، مع العزلة في نهاية المطاف من قبل تفارق الميكانيكية قوية. خلايا البنكرياس معزولة بهذه الطريقة عرض الخصائص الهيكلية والوظيفية غير طبيعي، لا سيما فقدان الهياكل قمية وأضرار كبيرة لمستقبلات الغشاء. ظلت الخلايا المعزولة قابلة للحياة فقط 1 أو 2 أيام.
فرقت إعداد يحافظ عنيبات داخل وبين الخلايا الهندسة المعمارية الخاصة بهم، والحفاظ على أغشية الخلايا، مما يحد من الأضرار التي لحقت المستقبلات السطحية، وبالتالي تحسين إفراز إفرازات ردا على secretagogues 6-8. باعتبارها دورة الفتشوبLT، وهذه الطريقة توفر الميزة الرئيسية لتمديد عنيبي بقاء الخلية إلى 7-10 أيام في المختبر. وعلاوة على ذلك، ويفضل هذا الأسلوب حاليا إلى العزلة خلية عنيبية 9-12 لأن صيانة من الاتصالات بين الخلايا، بما في ذلك اقتران الخلية عن طريق تقاطعات الفجوة، هو من العوامل الأساسية لإفرازات البنكرياس عنيبية الخلية النمط الظاهري 13.
كما فقد التمايز للخلايا عنيبية وtransdifferentiation على خلايا الأقنية هي واحدة من الآليات المقترحة لنشأة العدوانية سرطانات البنكرياس الإفرازية 14، وعنيبات نموذج فرقت هو أيضا نظام ملائم لدراسة اللدونة البنكرياس وآلياته الجزيئية لاحقة. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا 15،16 وتطوير تقنيات نقل الجينات (الغدانية 2 أو تنبيغ lentiviral، واستخدام الجسيمات النانوية، الخ)، وهذا في المختبر نموذج خلية عنيبية الأولية يمكن أنأن تكون مفيدة جدا في تحديد كيفية تأثير مختلف الاختلالات الجينية تنظيم عنيبي تمايز الخلايا أو فقد التمايز وينبغي توفير فهم أفضل للأحداث الجزيئية المسؤولة عن ظهور التهاب البنكرياس، الآفات السابقة للتسرطن، والتغيرات في اللدونة الخلية.
عزل فرقت عنيبات هو النهج التي نستخدمها في مختبرنا لخلايا البنكرياس عنيبية الثقافة. نحن هنا وصف ومناقشة الطريقة المستخدمة. أنها تنطوي تفارق الأنزيمية من نسيج البنكرياس (مع كولاجيناز البكتيرية) بالإضافة إلى اضطراب الميكانيكية دون تفكك خلايا عنيبية. في حين أن معظم بروتوكولات تشمل استزراع عنيبات، سواء في التعليق أو على ركائز من البلاستيك معاملة خاصة، ونحن تنمو لهم في التعليق لفترة وجيزة فقط (لمدة 24 ساعة)، بذر منهم بعد ذلك على السقالات مصفوفة إذا كان المطلوب زراعة الخلايا لفترات طويلة.
هذا البروتوكول يسمح العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من فرقت البنكرياس ACINI ومستدامة لمدة أسبوع واحد أو أكثر في الثقافة. لأنها تتيح عزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية في الماوس. بساطته يجعل من الممكن لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. عن طريق الحفاظ على الهندسة المعمارية داخل وبين الخلايا من عنيبات وبالتالي النمط الظاهري عنيبي من الخلايا الأولية معزولة، وهذا النموذج يشكل النظام خيارا بالنسبة للدراسة آليات transdifferentiation، كما تستمد جميع الموديلات البنكرياس الإفرازية الأخرى المتاحة حاليا من أورام البنكرياس عرض الوراثية العديد من التعديلات التي تؤدي إلى التحول الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن تصف الإجراء لعزل خلايا البنكرياس عنيبية. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لعزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا عنيبية لكل حيوان في أقل من 1 ساعة. بفضل التنفيذ السريع وبسيط والخمسين (ما يصل الى 10 البنكرياس يمكن معالجتها بشكل مستقل في التجربة بالتوازي)، يظهر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر موظفي AniCan (CRCL، ليون) للحصول على المساعدة الفنية مع رعاية الحيوان. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه إت دي لا بحوث ميديكال (برنامج أفينير INSERM)، الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان، من قبل الرابطة من أجل الديمقراطية بحوث السرطان سور جنيه، من قبل المعهد الوطني للسرطان، وزمالة من الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان (JG)، من المعهد الوطني للسرطان (JG)، من MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT العالي للبحوث وآخرون دي لا من فرنسا (RMP وDFV) ومن جمعية من أجل الديمقراطية بحوث سور جنيه السرطان ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
