マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養
Summary
本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。
Abstract
このプロトコルにより、1週間以上の文化でそれらを維持すること、マウス膵臓腺房の迅速な分離を（1時間未満）で許可されます。以上20×10 6個の腺房細胞は、単一のマウス膵臓から得ることができる。このプロトコルは、独立して並行してできるだけ多くの10のような膵臓を処理する可能性を提供しています。それは腺房構造を維持するため、このモデルが十分にそれらの腺房分化の部分的または全体的な損失をもたらす多くの遺伝的変化を表示膵臓腫瘍から樹立細胞株とは対照的に、 インビトロで外分泌膵臓の生理機能を研究するために適している。
Introduction
膵外分泌組織に取り組んで研究室のために頻繁に遭遇する問題は、十分な長さの長期的な実験を可能にするために一定の期間、in vitroで腺房細胞を培養することの難しさである。
このような培養系の開発を阻害する要因の一つは、それらが膵臓細胞の単離の間に放出されるとき文字通り膵臓組織を消化し、解糖タンパク質分解、および脂肪分解酵素の高い含有量に起因する実験的な操作に膵臓組織の固有感度である。
第二の要因は、その分泌特性を失い、例えば膵管細胞または肝細胞様細胞1のような他の成熟細胞への分化転換する傾向腺房細胞のin vitroでの著しい可塑性である。 インビトロにおいて 、この細胞可塑性実験条件によって変化する（このような培養培地の組成物として）2 </>（商標）と膵外分泌細胞の1のための適切な培養条件の設計に複雑さの度合いを紹介します。
いくつかの方法がモルモットの膵臓から第3-5、腺房細胞の単離および培養のために開発されてきた。当初、これらのプロトコルは、精力的な、機械的解離によって究極の分離と、コラゲナーゼ、キモトリプシン、およびプロテアーゼカクテルと共に膵臓組織の消化を関与。このように分離された膵臓細胞、特に異常な構造的および機能的特徴、構造及びそれらの頂端膜受容体に著しい損害の損失を示した。単離された細胞は、わずか1〜2日間に実行可能なままであった。
分散した腺房の調製は、細胞膜を維持表面受容体への損傷を制限するので、分泌6-8に応答して分泌外分泌を向上させる、それらの細胞内および細胞間のアーキテクチャを維持する。 RESUとしてLTは、この方法は、in vitroで 7-10日に腺房細胞の生存を延長の主な利点を提供しています。ギャップ結合による細胞結合を含む細胞間連絡先のメンテナンスが外分泌膵臓腺房細胞表現型13の重要な決定因子であるので、さらに、この方法は、現在9-12腺房細胞の分離に好適である。
腺房細胞と管細胞への分化の分化は、積極的な膵外分泌癌14の起源のために提案されたメカニズムの一つであるため、分散した腺房モデルはまた、膵臓の可塑性とその後の分子メカニズムを研究するための適切なシステムである。さらに、遺伝子改変動物15,16及び遺伝子転写技術の開発（2アデノウイルス又はレンチウイルス形質導入、ナノ粒子の使用など）の使用と組み合わせて、このインビトロプライマリ腺房細胞モデルにおける缶種々の遺伝的機能不全は、腺房細胞分化または分化の調節に影響を与え、膵炎、前癌病変、および細胞可塑性の変化の開始を担当する分子事象のより良い理解を提供する方法を決定する上で非常に有用である。
分散した腺房の分離は、我々は文化膵臓腺房細胞への我々の研究室で使うアプローチです。私たちは、ここで使用方法を説明し、議論する。これは、腺房細胞の解離せずに機械的破壊に結合された膵臓組織（細菌コラゲナーゼ付き）の酵素的解離を伴う。ほとんどのプロトコルは、培養腺房が関与しながら、どちらか懸濁液中または特別扱いプラスチック基板上に、我々は長期化、細胞培養が必要な場合はマトリックス足場に後でそれらを播種、（24時間）だけ簡潔に懸濁液中で、それらを育てる。
このプロトコルは、分散した膵臓交流の急速な分離を（1時間未満の場合）ができますiniファイル、文化の中で一週間以上の持続可能な。それは、マウスの膵臓あたり20以上×10 6腺房細胞の単離を可能にします。そのシンプルさは、それが可能な独立して並行してできるだけ多くの10のような膵臓を処理することができます。現在利用可能なすべての他の膵外分泌モデルは、多くの遺伝的表示膵臓腫瘍から誘導される細胞内および細胞間の腺房の構造、したがって、単離された初代細胞の腺房表現型を維持することによって、このモデルは、分化メカニズムの研究のための最適なシステムを構成する変化は、細胞形質転換につながる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、膵腺房細胞を単離するための手順を説明する。この方法は、1時間未満で動物枚以上20×10 6個の腺房細胞を単離することができる。その迅速かつ簡単な実装（のような多くの10と膵臓は独立並行して実験ごとに処理することができます）のおかげで、このプロトコルは、既存の単離法3-5,9-12,17の間の良好な妥協点として表示されます。
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、動物のケアとの技術支援のためにAniCanのスタッフ（CRCL、リヨン）に感謝。この作品は、協会注ぎラルシェルシュシュールルがんによって、研究所国立デュがんによって、およびからの奨学金によって研究所ナショナル·デ·ラ·サンテエ·デ·ラ·ルシェルシュMédicale（INSERMアベニールプログラム）、リーグ国立結界伤害防护结界ルがん、によってサポートされていました研究所国立デュがん（JG）から、フランスのMinistereはドゥEnseignement高等音楽エトデ·ラ·ルシェルシュ（RMPとDFV）から協会注ぐラルシェルシュシュールル蟹座（からリーグ国立結界伤害防护结界ルがん（JG）、 DFV）。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
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