小鼠原代胰腺腺泡细胞的分离和培养
Summary
在本出版物中，我们描述了一个快速，便捷的程序，用于隔离和培养主要从小鼠胰腺腺泡细胞。这种方法构成一个有价值的方法，以新鲜的正常/未转化的胰腺外分泌细胞的生理研究。
Abstract
此协议允许快速分离小鼠胰腺腺泡（少于1小时），使得有可能保持它们在培养一周以上。可以从一个单一的小鼠胰腺获得超过20×10 6个腺泡细胞。此协议可提供在独立处理多达10个并行胰腺。因为它保留腺泡结构，这种模式非常适合从胰腺肿瘤，这显示许多基因的改变，造成部分或者全部丧失腺泡分化的细胞系的建立在体外胰腺外分泌的生理研究。
Introduction
一个经常遇到的问题为研究实验室工作外分泌胰腺组织腺泡细胞在体外培养一段时间足够长，以允许长期实验的难度。
的一个因素阻碍这种培养系统的发展是由于在糖酵解，蛋白水解和脂解酶，字面消化的胰腺组织胰腺细胞的分离过程中，当它们被释放到高含量的实验操作胰腺组织所固有的灵敏度。
第二个因素是显着的体外可塑性腺泡细胞，这往往会失去它们的分泌特性和转分化其他成熟细胞，如胰腺导管细胞或肝细胞样细胞1。 在体外 ，这种细胞的可塑性变化与实验条件（如培养基成分）2 </燮>和适当的培养条件下，胰腺外分泌细胞的1到设计中引入了一定程度的复杂性。
已经开发了几种方法的腺泡细胞的分离和培养，从豚鼠胰腺3-5的第一。最初，这些协议涉及消化胰腺组织胶原酶糜蛋白酶和蛋白酶鸡尾酒的，剧烈的机械分离与最终的隔离。以这种方式分离的胰腺细胞显示异常的结构和功能特征，特别是根尖的结构和显着损害其膜受体的损失。分离出的细胞仍然是可行的只有1或2天。
制备分散，腺泡维护其内和细胞间的建筑，保护细胞膜，限制损坏表面受体，从而改善外分泌泌6-8。作为一个RESU，LT，这种方法提供延长7-10 天的体外腺泡细胞活力的主要优点。此外，这种方法目前优选的腺泡细胞分离9-12，因为维持细胞间的接触，包括通过间隙连接的细胞耦合，是一个重要的决定因素外分泌胰腺腺泡细胞表型的13。
由于去分化，腺泡细胞和导管上皮细胞转分化的起源积极的胰腺外分泌癌14建议的机制之一，分散腺泡模式也是足够的系统来研究胰腺癌的可塑性和其随后的分子机制。此外，在结合使用转基因动物的15,16和转基因技术的发展（2腺病毒或慢病毒转导，使用的纳米颗粒等），这可以在体外原腺泡细胞模型在确定各种遗传功能障碍如何影响腺泡细胞分化或去分化和调控，应该提供更好的了解胰腺炎的发作，癌前病变，细胞的可塑性变化的分子事件负责是非常有用的。
隔离分散腺泡是我们使用的方法，在我们的实验室中培养胰腺腺泡细胞。在这里，我们描述和讨论所采用的方法。它涉及酶解耦合无腺泡细胞的分离机械破碎胰腺组织（细菌胶原酶）。虽然大多数协议涉及培养腺泡，暂停或经过特殊处理的塑料基板，我们的成长他们只是简单地悬浮（24小时），播种之后如果需要长时间的细胞培养基质支架上。
此协议允许快速分离（少于1小时）分散胰交流INI，持续一个多星期的文化。它允许超过20×10 6每小鼠胰腺腺泡细胞的隔离。它的简单性使得能够处理多达10个独立的胰腺平行。保持腺泡内和细胞间的架构，从而腺泡分离的原代细胞的表型，这种模式构成了系统的首选转分化机制的研究，胰腺外分泌功能的机型，目前市面上的所有其他来自显示许多遗传性胰腺肿瘤改变导致细胞转化。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个协议中，我们描述了一个程序隔离胰腺腺泡细胞。在小于1小时，这种方法使得有可能超过20×10 6个腺泡细胞，每只动物隔离。由于其快速和简单的实现（多达10个胰腺可以被独立处理每个实验并行），该协议将出现一个很好的妥协之间的隔离方法3-5,9-12,17。
关键步骤/故障排除
这种方法的效率依赖在几个关键点上采取的预防?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢工作人员AniCan（CRCL，里昂），动物保健技术援助。这项工作是协会倾LA RECHERCHE SUR LE癌症研究所杜国家癌症研究所国家德拉健康等德拉RECHERCHEMédicale（INSERM艾文莉计划），国家法甲抗癌症，支持，并通过奖学金从国家法甲抗癌症（JG），从研究所国家杜癌症（JG），部DE L'ENSEIGNEMENT高等等德拉RECHERCHE法国（RMP和DFV）协会倾LA RECHERCHE SUR LE癌症（ DFV）。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
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