Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles
Summary
We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.
Abstract
Hierin beschrijven we een protocol voor het gelijktijdig meten van zes eiwitten in het speeksel met een vezeloptische-microsfeer gebaseerde antilichaam array. De immuno-array-technologie die combineert de voordelen van op microsfeer gebaseerde suspensie matrix productie met gebruik van fluorescentiemicroscopie. Zoals beschreven in de video-protocol, werden commercieel verkrijgbaar 4,5 urn polymeermicrosferen gecodeerd in zeven verschillende soorten, onderscheiden door de concentratie van twee fluorescente kleurstoffen fysiek opgesloten in de microsferen. De gecodeerde microsferen die oppervlak carboxylgroepen werden gewijzigd met monoklonale antilichamen capture via EDC / NHS koppeling chemie. Om het eiwit microarray assembleren, de verschillende soorten van gecodeerde en gefunctionaliseerde microbolletjes werden gemengd en willekeurig gestort in 4,5 urn microputjes, die chemisch werden geëtst op het proximale einde van een vezeloptische bundel. De vezeloptische bundel werd gebruikt als zowel een drager en voor het afbeelden van de microspheres. Afgewerkt, werd de microarray gebruikt om eiwitten te vangen in het speeksel supernatant verzameld uit de kliniek. De detectie is gebaseerd op een sandwich immunoassay met een mengsel van gebiotinyleerde detectie antilichamen voor verschillende analyten met een streptavidine-geconjugeerde fluorescente probe, R-fycoerythrine. De microarray werd afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in drie verschillende kanalen, twee voor microsfeer registratie en een voor de test signalen. De fluorescentie microfoto's werden vervolgens gedecodeerd en met een zelfgemaakte algoritme in MATLAB geanalyseerd.
Introduction
Sinds de eerste microarray gemeld door Mark Schena en collega's in het midden van de jaren 1990, heeft deze krachtige tool is gebruikt op vele terreinen van biologisch onderzoek 1. Antilichaam microarrays kan tegelijkertijd detecteren van meerdere eiwitten in diagnostische fluïda, zoals bloed, hebben belangrijke toepassingen in de klinische diagnostiek en biomarker screening 2-10. Speeksel, die veel van dezelfde analyten zoals bloed, wordt beschouwd als een beter alternatief voor bloed doordat speekselinzameling veilig, niet-invasieve, en kan door minimaal geschoold medisch personeel 11-13 worden uitgevoerd. Momenteel wordt gemultiplexte eiwitanalyse met speeksel door verscheidene belangrijke factoren, zoals de lage concentratie van doelanalyt 14 en breed concentratiegebied van verschillende biomarkers 15.
.Hierin tonen we de analyse van zes eiwit: humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interferon-gamma geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukine-8 (IL-8), epidermale groeifactor (EGF), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) en interleukine-1 bèta (IL-1β) . De prestaties van de werkwijze werd aanvankelijk gecontroleerd met standaardoplossingen vormen analyt recombinante eiwitten en blokkeerbuffer. Real speeksel monsters verzameld van patiënten met verschillende chronische aandoeningen van de luchtwegen en gezonde controles werden ook getest met bevredigende prestaties. Het protocol moet van toepassing zijn op andere eiwit analyten en andere-microbolletjes gebaseerde testen zijn. Dit platform biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van analytische chemie zoals maakt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare gelijktijdige analyse van lage concentraties van verscheidene eiwitten met een breed dynamisch bereik, minimale niet-specifieke interacties, verminderd monster en lage kosten in vergelijking met een analoog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoekers moeten extra aandacht besteden aan de volgende stappen: voor betere nauwkeurigheid decoderen, is het noodzakelijk te controleren of de microsferen werden homogeen gesuspendeerd in alle incubatie en wassen stappen tijdens de microsferen coderingsprocedure. Bovendien moeten de gecodeerde microbolletjes worden beschermd tegen licht gedurende het gehele experiment. Na juiste codering en opslagprocedures, vonden we dat algehele nauwkeurigheid decoderen was boven 99%. De gecodeerde microsferen moet worden bewaard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (subsidie 08UDE017788-05). EBP erkent ook steun van de Spaanse Stichting voor Wetenschap en Technologie (FECYT). De auteurs danken Shonda T. Gaylord en Pratyusha Mogalisetti voor kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
