Summary

הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

Published: October 10, 2013
doi:

Summary

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

Abstract

בזאת, אנו מתארים פרוטוקול למדידה בו זמנית שישה חלבונים המצויים ברוק באמצעות מערך נוגדנים מבוסס microsphere סיבים אופטיים. הטכנולוגיה חיסונית המערך מועסק משלבת את היתרונות של ייצור מערך השעיה מבוסס microsphere עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שתואר בפרוטוקול הווידאו, זעירים מפולימר 4.5 מיקרומטר זמין מסחרי היו מקודד לשבעה סוגים שונים, הנבדלים בריכוז של שני צבעי ניאון לכודים פיזי בתוך זעירים. Microspheres המקודד המכיל קבוצות carboxyl פני השטח שונו עם נוגדנים חד שבטיים ללכידה דרך הכימיה צימוד EDC / NHS. כדי להרכיב את microarray החלבון, הסוגים השונים של זעירים ממקודדים ופונקציונלית היו מעורבים ושהופקדו באופן אקראי ב4.5 מיקרומטר microwells, שנחרתו כימיים בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים. צרור סיבים האופטיים שימש גם כמוביל והדמיה מ 'icrospheres. לאחר הרכבה, microarray שימש כדי ללכוד חלבונים בsupernatant הרוק שנאסף מהמרפאה. זיהוי התבסס על immunoassay כריך באמצעות תערובת של נוגדנים לזיהוי biotinylated לanalytes שונה עם בדיקה ניאון streptavidin מצומדות, R-phycoerythrin. Microarray היה צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלושה ערוצים שונים, שני לרישום microsphere ואחת לאות assay. Micrographs הקרינה אז היו מפוענח ונותח באמצעות אלגוריתם תוצרת בית בMATLAB.

Introduction

מאז microarray הראשון שדווח על ידי מארק Schena ועמיתים לעבודה באמצע 1990, כלי רב עוצמה זה נוצל בתחומים רבים של מחקר ביולוגי 1. microarrays נוגדנים המסוגל בו זמנית גילוי חלבונים רבים בנוזלי אבחון, כגון דם, יש יישומים חשובים באבחון קליני והקרנת סמן 2-10. רוק, המכיל רבים מאותו analytes כמו דם, כבר נחשב כחלופה עדיפה על דם בגלל אוסף רוק הוא בטוח, לא פולשנית, ויכול להתבצע על ידי אנשי צוות רפואיים מאומנים מינימאלי 11-13. נכון לעכשיו, ניתוח חלבון מרובב באמצעות דגימות רוק הוא מוגבל על ידי מספר גורמים חשובים, כוללים הריכוז הנמוך של חומר אנליטי יעד 14 וטווח הריכוז הרחב של סמנים ביולוגיים שונים 15.

.

בזאת, אנחנו מדגימים את הניתוח של שישה חלבונים: גורם אנושי אנדותל כלי דם צמיחה (VEGF), חלבון מושרה אינטרפרון גאמא 10, metallopeptidase מטריצה ​​9 (MMP-9), ובטא interleukin-1 (IP-10, interleukin-8 (IL-8), גורם הגדילה באפידרמיס) (EGF) (IL-1β) . הביצועים של השיטה בתחילה אומת באמצעות פתרונות סטנדרטיים המהווים חלבוני אנליטי רקומביננטי וחסימת מאגר. דגימות רוק אמיתיות שנאספו מחולים במחלות נשימה כרוניות שונות, כמו גם ביקורת בריאה נבדקו גם עם ביצועים משביעי רצון. הפרוטוקול צריך להיות ישים analytes חלבון אחר ומבוסס מבחני microsphere אחרים. פלטפורמה זו מציעה יתרונות משמעותיים בתחום הכימיה אנליטית כפי שהיא מאפשרת ניתוח סימולטני מהיר, מדויק, ושחזור של ריכוזים נמוכים של כמה חלבונים עם מגוון רחב דינמי, אינטראקציות לא ספציפיים מינימליות, צריכת מדגם מופחתת, ועלות נמוכה בהשוואה ל Assay הצמוד אנזימים מקבילים immunosorbent (ELISA).

Protocol

איור 1. . זרימת עבודה ליישום מערך נוגדני microsphere סיבים אופטיים לאפיון רוק (1) מיקרוסכמות מקודדות באופן פנימי עם שני צבעי ניאון, (2) זעירים המקודדים משתנים חיצוני עם נוגדנים חד שבטי…

Representative Results

תמונות הקרינה משלושה ערוצים מראים קטע קטן של צרור סיבים האופטיים מוצגות איורים 2A-C. תמונות אלה נותחו באמצעות אלגוריתם שנכתב ב MATLAB (כפי שמתוארת בפירוט רב יותר בסעיף הדיון). הניתוח מעסיק גם מידע מתמונת Eu-TTA הקידוד (איור 2 א) ואת תמונת קידוד C30 (איור 2)</…

Discussion

חוקרים צריכים לשים לב במיוחד לשלבים הבאים: לדיוק פענוח טוב יותר, יש צורך לאמת את microspheres הושעו הומוגנית בכל הדגירה ולשטוף צעדים במהלך הליך הקידוד זעירים. בנוסף, זעירים מהמקודדים צריכים להיות מוגן מפני אור לאורך כל הניסוי. לאחר תהליכי קידוד והאחסון נאותים, מצאנו כי דיו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 08UDE017788-05). EBP גם מכיר תמיכת הקרן הספרדית למדע וטכנולוגיה (FECYT). המחברים מודים שונדה ט גיילורד וPratyusha Mogalisetti לקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
Eu-TTA dye Fisher Scientific AC42319-0010
THF Sigma-Aldrich 34865-100ML
Amber glass vial Fisher Scientific 03-339-23B
Coumarin 30 dye Sigma-Aldrich 546127-100MG
Microspheres Bangslabs PC05N/6698
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
PBS 10x concentrate Sigma-Aldrich P5493-1L
Water Sigma-Aldrich W4502-1L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich P7949-100 ml
BupH MES buffered saline Thermo Scientific 28390
SDS Sigma-Aldrich 05030-500ML-F
NaOH solution Fisher Scientific SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube VWR labshop 53511-997
EDC Thermo Scientific 22980
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510
Human VEGF capture antibody R&D Systems MAB293
Human IP-10 capture antibody R&D Systems MAB266
Human IL-8 capture antibody R&D Systems MAB208
Human EGF capture antibody R&D Systems MAB636
Human MMP-9 capture antibody R&D Systems MAB936
Human IL-1β capture antibody R&D Systems MAB601
Mouse IgG1 isotype control antibody R&D Systems MAB002
StartingBlock (TBS) buffer Thermo Scientific 37542
HCl standard solution 1.0 N Sigma-Aldrich 318949-500 ml
0.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
Protein-free (PBS) buffer Thermo Scientific 37572
Recombinant human VEGF 165 R&D Systems 293-VE
Recombinant human IP-10 R&D Systems 266-IP
Recombinant human IL-8 R&D Systems 208-IL
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG
Recombinant human MMP-9 R&D Systems 911-MP
Recombinant human IL-1β R&D Systems 201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer Thermo Scientific 37539
Blocker BSA in PBS Thermo Scientific 37525
Biotinylated VEGF detection antibody R&D Systems BAF293
Biotinylated IP-10 detection antibody R&D Systems BAF266
Biotinylated IL-8 detection antibody R&D Systems BAF208
Biotinylated EGF detection antibody R&D Systems BAF236
Biotinylated MMP-9 detection antibody R&D Systems BAF911
Biotinylated IL-1β detection antibody R&D Systems BAF201
Streptavidin, R-phycoerythrin Invitrogen S-21388
Ethanol (200 proof) Sigma-Aldrich E7023-500ML

References

  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
  4. Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
  5. de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
  6. Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
  7. Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
  8. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  9. Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
  10. Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
  11. Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
  12. Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
  13. Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
  14. St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
  15. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
  16. Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
  17. Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).

Play Video

Cite This Article
Nie, S., Benito-Peña, E., Zhang, H., Wu, Y., Walt, D. R. Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles. J. Vis. Exp. (80), e50726, doi:10.3791/50726 (2013).

View Video