Summary

Multiplexed Люминесцентная микрочипов для человека слюнных анализа белка с использованием полимерных микросфер и волоконно-оптических Связки

Published: October 10, 2013
doi:

Summary

Мы описываем процедуру для профилирования белки слюны, используя мультиплексированных массивы антител микросфер на основе. Моноклональные антитела ковалентно связаны с флуоресцентными красителями кодируется 4,5 мкм полимерных микросфер с использованием карбодиимида химии. Модифицированные микросферы были депонированы в волоконно-оптических лунки для измерения уровня белка в слюне с помощью сэндвич-флуоресценции иммунологические.

Abstract

Здесь мы опишем протокол для одновременного измерения шесть белков в слюне с помощью микросфер на основе массива антител оптоволоконный. Технология иммуно-массив использованы сочетает в себе преимущества микросфер на основе подвески изготовления матрицы с использованием флуоресцентной микроскопии. Как описано в протоколе видео, коммерчески доступные 4,5 мкм полимерные микросферы были закодированы в семи различных типов, различаемых по концентрации двух флуоресцентных красителей физически ловушке внутри микросфер. Кодированные микросферы, содержащие поверхностные карбоксильные группы были изменены с помощью моноклональных антител захвата через EDC / NHS связи химии. Для сборки белка микрочипов, различные типы кодированных и функционализированных микросфер были смешаны и случайным образом на хранение в 4,5 мкм лунки, которые были химическому травлению на проксимальном конце волоконно-оптического пучка. Волоконно-оптический пучок был использован и как носителя и для визуализации мicrospheres. После сборки, микрочипов был использован для захвата белков в слюне супернатант собирали из клиники. Детектирование на основе сэндвич-иммуноанализа с использованием смеси биотинилированных антител обнаружения для различных аналитов с стрептавидином, конъюгированным флуоресцентного зонда, R-фикоэритрином. Микрочипов был сфотографирован с помощью флуоресцентной микроскопии в трех различных каналов, по два для регистрации микросфер и один для сигнала анализа. Флуоресцентные микрофотографии были затем декодируются и проанализированы с помощью самодельного алгоритм в MATLAB.

Introduction

С первого микрочипов сообщил Марк Schena и коллегами в середине 1990-х, этот мощный инструмент был использован во многих областях биологических исследований 1. Антитела микрочипы, способные одновременно обнаруживать несколько белков в диагностических жидкостей, таких как кровь, имеют важное применение в клинической диагностике и скрининге биомаркеров 2-10. Слюна, содержащий многие из тех же аналитов как кровь, была рассмотрена в качестве предпочтительной альтернативой крови, потому что сбор слюны является безопасным, неинвазивным, и может быть осуществлена ​​с помощью минимально-квалифицированного медицинского персонала 11-13. В настоящее время мультиплексированный анализ белка с использованием образцов слюны ограничен несколькими важными факторами, в том числе низкой концентрации заданного анализируемого вещества 14 и широкого диапазона концентраций различных биомаркеров 15.

.

При этом мы показали, анализ шести белков: сосудистый эндотелиальный фактор роста человека (VEGF), интерферон гамма-индуцированный белок 10 (IP-10), интерлейкин-8 (IL-8), эпидермальный фактор роста (EGF), матрица metallopeptidase 9 (ММП-9) и интерлейкина-1 бета (IL-1β) . Выполнение метода была первоначально проверена с использованием стандартных растворов рекомбинантных белков, составляющих анализируемого вещества и блокирующем буфере. Реальные образцы слюны, собранные от пациентов различных хронических заболеваний органов дыхания, а также здоровых были также проверены с удовлетворительной работы. Протокол должен быть применим и к другим белковых аналитов и других микросфер на основе анализов. Эта платформа дает значительные преимущества в области аналитической химии, так как позволяет быстро, точно, и воспроизводимое одновременный анализ низких концентрациях нескольких белков с широким динамическим диапазоном, минимальных неспецифических взаимодействий, снижение потребления образца, и низкой стоимости по сравнению с Аналогичный иммуноферментный анализ (ELISA).

Protocol

Рисунок 1. . Рабочий процесс для применения волоконно-оптический массив микросфер антител в слюне профилирования (1) Микросферы внутренне закодированные с помощью двух флуоресцентных красите…

Representative Results

Флуоресцентные изображения из трех каналов, показывающих небольшой участок волоконно-оптического пучка показаны на рисунках 2A-C. Эти изображения были проанализированы с использованием алгоритма, написанный на MATLAB (как описано более подробно в разделе обсуждение). Анализ исп?…

Discussion

Исследователи должны обратить особое внимание на следующие шаги: для большей точности декодирования, необходимо проверить эти микросферы равномерно приостановлено по всей инкубации и мыть шаги во время процедуры кодирования микросферы. Кроме того, кодированные микросферы должны бы?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (грантов 08UDE017788-05). EBP также признает поддержку от испанского фонда по науке и технике (FECYT). Авторы благодарят Шонда Т. Gaylord и Pratyusha Mogalisetti за критическое прочтение рукописи.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
Eu-TTA dye Fisher Scientific AC42319-0010
THF Sigma-Aldrich 34865-100ML
Amber glass vial Fisher Scientific 03-339-23B
Coumarin 30 dye Sigma-Aldrich 546127-100MG
Microspheres Bangslabs PC05N/6698
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
PBS 10x concentrate Sigma-Aldrich P5493-1L
Water Sigma-Aldrich W4502-1L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich P7949-100 ml
BupH MES buffered saline Thermo Scientific 28390
SDS Sigma-Aldrich 05030-500ML-F
NaOH solution Fisher Scientific SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube VWR labshop 53511-997
EDC Thermo Scientific 22980
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510
Human VEGF capture antibody R&D Systems MAB293
Human IP-10 capture antibody R&D Systems MAB266
Human IL-8 capture antibody R&D Systems MAB208
Human EGF capture antibody R&D Systems MAB636
Human MMP-9 capture antibody R&D Systems MAB936
Human IL-1β capture antibody R&D Systems MAB601
Mouse IgG1 isotype control antibody R&D Systems MAB002
StartingBlock (TBS) buffer Thermo Scientific 37542
HCl standard solution 1.0 N Sigma-Aldrich 318949-500 ml
0.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
Protein-free (PBS) buffer Thermo Scientific 37572
Recombinant human VEGF 165 R&D Systems 293-VE
Recombinant human IP-10 R&D Systems 266-IP
Recombinant human IL-8 R&D Systems 208-IL
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG
Recombinant human MMP-9 R&D Systems 911-MP
Recombinant human IL-1β R&D Systems 201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer Thermo Scientific 37539
Blocker BSA in PBS Thermo Scientific 37525
Biotinylated VEGF detection antibody R&D Systems BAF293
Biotinylated IP-10 detection antibody R&D Systems BAF266
Biotinylated IL-8 detection antibody R&D Systems BAF208
Biotinylated EGF detection antibody R&D Systems BAF236
Biotinylated MMP-9 detection antibody R&D Systems BAF911
Biotinylated IL-1β detection antibody R&D Systems BAF201
Streptavidin, R-phycoerythrin Invitrogen S-21388
Ethanol (200 proof) Sigma-Aldrich E7023-500ML

References

  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
  4. Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
  5. de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
  6. Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
  7. Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
  8. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  9. Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
  10. Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
  11. Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
  12. Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
  13. Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
  14. St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
  15. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
  16. Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
  17. Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).

Play Video

Cite This Article
Nie, S., Benito-Peña, E., Zhang, H., Wu, Y., Walt, D. R. Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles. J. Vis. Exp. (80), e50726, doi:10.3791/50726 (2013).

View Video