JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Published: October 21, 2013
doi:
10.3791/50771
, , ,
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering,West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,University of California at Riverside

Summary

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

Abstract

מאמצים כבר התמקדו בפיתוח במבחני חוץ גופית ללימוד microvessels משום in vivo מחקרים בבעלי החיים נמצאים זמן רב יותר, יקר, ותצפית וכימות הם מאוד מאתגרים. עם זאת, יש לי קונבנציונלי במבחני microvessel מבחנה מגבלות כאשר מייצגים in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה תלת ממדי (3D) ומתן זרימת נוזל רציף. באמצעות שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה, פיתחנו endothelialized חתך עגול רב מעמיק microchannels-on-a-chip, אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זלוף הרציף המבוקר זרימה. Photoresist reflowable חיובי שימש לפברק עובש הורים עם רשת microchannel חתך חצי עגולה. על ידי היישור והמליטה של ​​שני polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated מעובש האב, רשת microchannel גלילית נוצרה. בקטרים ​​של microchannels יכולים להיות מבוקרים היטב. בנוסף לכך, תאים ראשוניים אדם טבור וריד אנדותל (HUVECs) נזרעו בתוך השבב הראו כי התאים מרופדים משטח הפנימי של microchannels תחת זלוף המבוקר שנמשך פרק זמן בין 4 ימים ועד 2 שבועות.

Introduction

Microvessels, כחלק ממערכת מחזור הדם, לתווך האינטראקציות בין דם וברקמות, תומך בפעילות המטבולית, להגדיר microenvironment רקמות, ולשחק תפקיד קריטי במצבים פתולוגיים רבות ובריאות. שחזור של microvessels תפקודי במבחנה יכול לספק פלטפורמה למחקר של תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מקובל במבחני microvessel מבחנה, כגון מבחני נדידת תאי אנדותל, מבחני היווצרות צינור אנדותל, מבחני טבעת אבי העורקים חולדה ועכבר, לא מצליחין לשחזר את in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה (3D) תלת ממדים ובקרת זרימה רציפה 1-8. מחקרים של microvessels באמצעות מודלים של בעלי חיים ובמבחני vivo, כגון assay אנגיוגנזה בקרנית, assay אנגיוגנזה קרום chorioallantoic אפרוח, וassay תקע Matrigel, הם יותר גוזלים זמן, גבוהים בעלות, מאתגרים ביחס להתבוננות וquantifications, ולהעלות סוגיות אתיות 1, 9-13.

התקדמות בmicromanufacturing וטכנולוגיות שבב microfluidic אפשרה מגוון של תובנות המדעים ביו תוך צמצום העלויות והמורכבויות הניסיוניות הגבוהות הקשורות בבעלי חיים ובvivo 14 מחקרים, כגון תנאים ביולוגיים לשלוט בקלות ובאופן הדוק וסביבות fluidic דינמיות, שלא היה היה אפשרי עם טכניקות macroscale קונבנציונליות.

כאן, אנו מציגים גישה לבנות endothelialized microchannels-on-a-chip אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת על ידי שימוש בשילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה.

Protocol

1. ייצור photolithography של עובש מאסטר Photoresist הפרוטוקול הבא מציג את התהליך לפברק את microchannels עם קטרים ​​בין 30-60 מיקרומטר. כדי לקבל microchannel בקוטר קטן (פחות מ 30 מיקרומטר), ציפוי ספין יחיד של photoresist יש צורך. <li style=";text-align:…

Representative Results

הגישה שלנו לפברק רשת microchannel רב מעמיקה מחקה את גיאומטריות 3D המורכבות של in vivo microvessels, שבו יש לי microchannels מעוגל חתכים 15. בנוסף, בקטרים ​​של ערוצי הסתעפות הוריים ובת הערוצים כ לציית לחוק של מוריי לשמירה על זרימת הנוזל ברמה נדרשת, כך שהתנגדות הערוץ הכללית היא נמו?…

Discussion

1. ייצור עובש מאסטר

אחד העקרונות המנחים את עיצוב ולmorphometry כלי דם ידוע כדין של מוריי 16, שבו נקבע כי חלוקת קטרי כלי ברחבי הרשת נשלטת על ידי שיקול מינימום אנרגיה. גם הוא קובע כי הקובייה של הקטרים ​​של כלי הורה בהסתעפות שווה לסכ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF 1,227,359), תכנית WVU EPSCoR מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (EPS-1,003,907), המשרד מראש WVU בחסות הקרן הלאומי למדע (1,007,978), וWVU PSCoR, בהתאמה. עבודת microfabrication נעשתה במתקני WVU משותפים מחקר (מתקני חדר נקיים) ומחקר נייד אינטגרטיבית Microfluidic במעבדת צ'יפ (שבב מעבדה) באוניברסיטת וירג'יניה המערבית. ההדמיה confocal נעשתה במתקן ההדמיה מיקרוסקופ WVU.

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
  31. O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).

Tags

Keywords: Multi-depth Circular Cross-sectional MicrochannelsEndothelialized MicrochannelsIn Vitro Microvessels3D GeometryContinuous Fluid FlowPhotolithographic ReflowSoft LithographyMicrofluidicsPDMSPrimary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)Perfusion
check_url/cn/50771?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image