Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Summary

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Abstract

Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos in vitro para el estudio de microvasos porque en estudios con animales in vivo son más que consume tiempo, es caro, y la observación y cuantificación son muy desafiante. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro tienen limitaciones cuando se representa en microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y proporcionar flujo de fluido continuo. Usando una combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos, hemos desarrollado un multi-profundidad endotelializadas transversales circulares microcanales-on-a-chip, que imita a la geometría 3D en vivo microvasos y se ejecuta bajo perfusión continua controlada flujo. Un fotoprotector reflowable positivo se utilizó para fabricar un molde principal con una red de microcanales de sección transversal semicircular. Por la alineación y unión de los dos (PDMS) microcanales polidimetilsiloxano replicated del molde maestro, se creó una red de microcanales cilíndrica. Los diámetros de los microcanales pueden ser bien controlados. Además, las células primarias endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) sembradas dentro del chip mostraron que las células se alineaban en la superficie interior de los microcanales de acuerdo con la perfusión controlada duradera para un período de tiempo entre 4 días a 2 semanas.

Introduction

Los microvasos, como una parte del sistema de circulación, median las interacciones entre la sangre y los tejidos, apoyar las actividades metabólicas, definir microambiente del tejido, y desempeñan un papel crítico en muchas condiciones patológicas y de salud. Recapitulación de microvasos funcionales in vitro podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejas. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro, tales como ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de formación de tubos endoteliales, y ensayos de anillos aórticos de rata y de ratón, no son capaces de recrear la microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y de control de flujo continuo ^1-8. Estudios de microvasos utilizando modelos animales y en ensayos in vivo, tales como ensayo de angiogénesis corneal, ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoidea de pollo, y el ensayo de tapón de Matrigel, son más tiempo, alta en costo, desafiando con respecto a la observación y cuantificaciones, yplantear cuestiones éticas ^{1, 9-13.}

Los avances en la microfabricación y tecnologías de chips de microfluidos han permitido una gran variedad de conocimientos sobre ciencias biomédicas, mientras reduciendo el alto costo y la complejidad asociados con los animales de experimentación y en estudios in vivo ^14, como las condiciones biológicas controladas fácilmente y firmemente y entornos fluidos dinámicos, que no tendrían sido posible con las técnicas convencionales macroescala.

A continuación, presentamos un método para construir un endotelizado microcanales-on-a-chip que imita la geometría 3D de in vivo microvasos y se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada mediante el uso de la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos.

Protocol

1. La fotolitografía Fabricación de Fotoresinas Molde Maestro El siguiente protocolo muestra el proceso para la fabricación de los microcanales con diámetros entre 30-60 micras. Para obtener un microcanal con un diámetro más pequeño (menos de 30 micras), un solo giro de recubrimiento de resina fotosensible se necesita. Transferir la resina fotosensible reflujo de la nevera a 4 ° C para la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente. <…

Representative Results

Nuestro enfoque para la fabricación de la red de microcanales de múltiples profundidad imita las complejas geometrías 3D de microvasos in vivo, en el que los microcanales han redondeado las secciones transversales 15. Además, los diámetros de los canales de ramificación matrices y los canales de memoria de aproximadamente obedecen la ley de Murray para mantener el flujo de fluido a un nivel requerido para que la resistencia total del canal es baja y velocidades de flujo son más uniforme en tod…

Discussion

1. Fabricación del molde maestro

Uno de los principios rectores para el diseño y la morfometría vascular se conoce como la ley de Murray ^16, que establece que la distribución de los diámetros de los vasos a lo largo de la red se rige por consideraciones de energía mínimo. También establece que el cubo de los diámetros de un vaso principal en una bifurcación es igual a la suma de los cubos de los diámetros de los vasos hija ( <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="0…

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 and PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
PDMS Curing Agent	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator	BelArt Products	999320237
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
Syringe Pump System	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optical Microscope	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510