Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Summary

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Abstract

Gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di test in vitro per lo studio dei microvasi, perché in vivo sugli animali sono più in termini di tempo, costosa, e l'osservazione e quantificazione sono molto impegnativo. Tuttavia, convenzionale in microvasi saggi in vitro hanno dei limiti quando rappresentano in vivo microvasi rispetto alla geometria tridimensionale (3D) e di fornire il flusso del fluido continuo. Usando una combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica, abbiamo sviluppato un multi-profondità endothelialized trasversali circolari microcanali-on-a-chip, che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto perfusione continua controllata flusso. Un fotoresist positivo reflowable stato usato per fabbricare uno stampo matrice con una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare. Dall'allineamento e incollaggio dei due polidimetilsilossano (PDMS) microcanali replicated dallo stampo maestro, è stata creata una rete di microcanali cilindrica. I diametri dei microcanali possono essere ben controllate. Inoltre, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC primarie) seminate all'interno del chip hanno mostrato che le cellule allineate la superficie interna dei microcanali sotto perfusione controllata duraturo per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.

Introduction

Microvasi, come parte del sistema di circolazione, mediare le interazioni tra sangue e tessuti, sostenere attività metaboliche, definire microambiente tissutale, e gioca un ruolo critico in molte condizioni patologiche e salute. Ricapitolazione dei microvasi funzionali in vitro potrebbe fornire una piattaforma per lo studio dei fenomeni vascolari complesse. Tuttavia, convenzionale in vitro microvasi saggi, come il test di migrazione delle cellule endoteliali, saggi di formazione endoteliali tubo, e di ratto e topo saggi anello aortico, sono in grado di ricreare in vivo microvasi rispetto a tre dimensioni (3D) geometria e il controllo di flusso continuo ^1-8. Studi di microvasi utilizzando modelli animali e in vivo, come il saggio di angiogenesi corneale, pulcino corioallantoidea membrana saggio angiogenesi, e il dosaggio spina Matrigel, sono di più in termini di tempo, ad alto costo, sfidando rispetto alla osservazione e quantificazioni, esollevare questioni etiche ^{1, 9-13.}

I progressi nella micromanufacturing e tecnologie nell'ambito dei chip microfluidici hanno permesso una serie di intuizioni in scienze biomediche, mentre limitare gli alti costi sperimentali e le complessità associati con gli animali e in vivo studi ^14, come le condizioni biologiche controllate facilmente e saldamente e ambienti fluidi dinamici, che non avrebbero stato possibile con tecniche convenzionali macroscala.

Qui vi presentiamo un metodo per costruire un endothelialized microcanali-on-a-chip che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto flusso di perfusione continua controllato utilizzando la combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica.

Protocol

1. Fotolitografia Fabbricazione di Photoresist Maestro Mold Il seguente protocollo mostra il processo per fabbricare i microcanali con diametri tra 30-60 micron. Per ottenere un microcanali con un diametro più piccolo (meno di 30 um), un singolo spin-coating di photoresist è necessario. Trasferire il photoresist reflow dal frigorifero a 4 ° C per la camera sterile 24 ore prima dell'uso e lasciarla a temperatura ambiente. Pulire un wafer di silicio e cuocere per un…

Representative Results

Il nostro approccio per fabbricare la rete di microcanali multi-profondità imita le complesse geometrie 3D di microvasi in vivo, in cui i microcanali sono arrotondate sezioni trasversali 15. Inoltre, i diametri dei canali di ramificazione madri ei canali figlia circa obbediscono legge di Murray per mantenere il flusso di fluido ad un livello desiderato in modo che la resistenza complessiva del canale è bassa e velocità di flusso sono più uniforme in tutta la rete 16-18. I processi e ri…

Discussion

1. Muffa fabbricazione Maestro

Uno dei principi di progettazione e di guida per morfometria vascolare è nota come legge di Murray ^16, in cui si afferma che la distribuzione dei diametri dei vasi in tutta la rete è governata da corrispettivo minimo di energia. Si precisa inoltre che il cubo dei diametri di un vaso parente ad una biforcazione uguale alla somma dei cubi dei diametri dei vasi figlia ( <img alt="Equazione 1" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771…

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 and PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
PDMS Curing Agent	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator	BelArt Products	999320237
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
Syringe Pump System	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optical Microscope	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510