Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Summary

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Abstract

Die Anstrengungen haben sich auf die Entwicklung in-vitro-Assays zur Untersuchung der Mikrogefäßen konzentriert, weil in vivo Tierstudien mehr zeitaufwendig, teuer und Beobachtung und Quantifizierung sind sehr anspruchsvoll. Jedoch haben herkömmliche in vitro Assays microvessel Einschränkungen bei der Darstellung in vivo microvessels bezüglich dreidimensionale (3D)-Geometrie und eine kontinuierliche Strömung. Mit einer Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik, haben wir eine Multi-Tiefe kreisförmigen Querschnitt endothelialisierten entwickelt Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierliche Perfusion fließen. Eine positive reflowable Photoresist wurde verwendet, um eine Master-Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanal Netzwerk herzustellen. Nach der Ausrichtung und Verbindung der beiden Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle ersicated von der Urform wurde ein zylindrischer Mikrokanal Netzwerk erstellt. Die Durchmesser der Mikrokanäle kann gut beherrscht. Darüber hinaus zeigte primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) innerhalb des Chips ausgesät, dass die Zellen mit der Innenfläche der Mikrokanäle ausgekleidet unter kontrollierten Perfusion dauernd für einen Zeitraum von 4 Tagen bis 2 Wochen.

Introduction

Mikrogefäßen als Teil des Kreislaufsystems, vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gewebe, unterstützt Stoffwechselaktivitäten, definieren Gewebe Mikroumgebung und spielen eine entscheidende Rolle in vielen Gesundheits-und pathologischen Bedingungen. Zusammenfassung der funktionellen microvessels in vitro konnte eine Plattform für die Untersuchung von komplexen vaskulären Erscheinungen bereitzustellen. Jedoch sind herkömmliche in vitro Assays microvessel wie Endothelzellmigration Assays Bildung endothelialer Gefäße Assays und Ratte und Maus Aortenring Assays nicht die in vivo microvessels neu in Bezug auf dreidimensionale (3D)-Geometrie und kontinuierlichen Steuerung ^1-8. Studium der Mikrogefäßen anhand von Tiermodellen und in-vivo-Untersuchungen, wie Hornhaut-Angiogenese-Assay, chick Chorioallantoismembran Angiogenese Assay und Matrigel-Plug-Assay sind zeitaufwendiger, hohe Kosten, herausfordernde bezüglich Beobachtung und Quantifizierung undethische Fragen aufwerfen, ^{1, 9-13.}

Advances in Mikrotechnik und Mikrofluidik-Chip-Technologien haben eine Vielzahl von Einblicken in biomedizinischen Wissenschaften aktiviert, während beschneidet die hohen experimentellen Kosten und Komplexitäten mit Tieren und in vivo-Studien ^14, wie einfach und streng kontrolliert biologischen Bedingungen und dynamischen Umgebungen Fluidik, die nicht hätten zugeordnet war mit herkömmlichen makroskopischen Techniken möglich.

Hier präsentieren wir einen Ansatz für eine endothelialisierten konstruieren Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss durch die einzigartige Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie, und Mikrofluidik.

Protocol

1. Photolithographie Herstellung von Fotolack Meister Mold Das folgende Protokoll zeigt den Prozess, um die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30-60 um herzustellen. Um einen Mikrokanal mit einem kleineren Durchmesser (weniger als 30 Mikrometer), einem Dreh-Beschichtung aus Photoresist zu erhalten benötigt. Übertragen Sie die Reflow Fotolack aus dem Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Reinraum 24 Stunden vor dem Gebrauch und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen. …

Representative Results

Unser Ansatz für die Multi-Tiefe Mikrokanalstruktur Netzwerk herzustellen ahmt die komplexen 3D-Geometrien in vivo Mikrogefäßen, in denen die Mikrokanäle haben abgerundete Querschnitte 15. Darüber hinaus sind die Durchmesser der übergeordneten Verzweigung Kanäle und die Kanäle Tochter etwa gehorchen Murray Gesetz zur Aufrechterhaltung der Fluidströmung an einen erforderlichen Pegel, so dass der gesamte Kanal ist niedrig und Strömungsgeschwindigkeiten gleichmäßiger im gesamten Netzwerk <su…

Discussion

1. Meister Formenbau

Einer der Gestaltung und Leitprinzipien für vaskuläre Morphometrie als Murray Gesetz ^16, was bedeutet, dass die Verteilung der Gefäßdurchmesser im gesamten Netzwerk von Mindestanforderungen an die Gesamtenergieeffizienz Gegenleistung regierten Staaten bekannt. Weiter heißt es, dass der Würfel der Durchmesser eines Elternteils Gefäß an einer Verzweigung der Summe der Potenzen der Durchmesser der Tochter Schiffe gleich ( <img alt="Gleichung 1" fo:cont…

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 and PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
PDMS Curing Agent	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator	BelArt Products	999320237
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
Syringe Pump System	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optical Microscope	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510