Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em> In-vitro-</em> Und<em> In Vivo</em>, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren
Summary
Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.
Abstract
Entwicklungs Ereignisse im Gehirn einschließlich der neuronalen Morphogenese und Migration sind hoch orchestriert Prozesse. In-vitro-und in vivo-Analysen erlauben eine detaillierte Charakterisierung von Wegen an diesen Veranstaltungen beteiligt sind. Kleinhirnkörnerzellen (CGN), die von sich entwickelnden Kleinhirn abgeleitet werden, sind ein ideales Modell-System, das für die morphologische Analysen ermöglicht. Hier beschreiben wir eine Methode, wie man genetisch zu manipulieren, CGN und wie axono-und dendritogenesis von einzelnen Nervenzellen zu studieren. Mit diesem Verfahren werden die Auswirkungen der RNA-Interferenz, Überexpression oder kleinen Molekülen verglichen werden, um Nervenzellen zu steuern. Darüber hinaus ist das Nagetier Kleinhirnrinde ein leicht in vivo-System zugänglich aufgrund ihrer vorherrschenden postnatale Entwicklung. Wir präsentieren auch eine in vivo Elektroporation Technik genetisch zu manipulieren und die Entwicklung von Kleinhirn Kleinhirn beschreiben nachfolgenden Analysen eine neuronale Morphologie beurteilennd Migration.
Introduction
Das Kleinhirn ist ein ausgezeichnetes System, die Mechanismen der Axon Wachstum und Migration zu untersuchen. Das Kleinhirn hat sich seit den Anfängen der Neurowissenschaften ein Gegenstand von anatomischen Studien. Moderne Mikroskopie und immunhistochemischen Techniken erheblich erweitert und verfeinert die ersten Entdeckungen von Santiago, Ramon und Cajal 2-4. Maus-Genetik und molekulare Untersuchungen aufgedeckt wesentliche Wachstums-und Transkriptionsfaktoren bei der Kontrolle der Entwicklung des Kleinhirns, die zu einem besseren Verständnis der entscheidenden Ereignisse der richtigen Verkabelung von verschiedenen Arten von Neuronen, einschließlich Kleinhirnkörnerzellen (CGN) 7.5 erforderlich geführt.
Das Kleinhirn ist ein Derivat von Rhombomer 1 der Entwicklungs hindbrain 8. Die rhombische Lippe, die einen Teil des Daches des 4. Ventrikels, entsteht Kleinhirn-Körner Neuron Vorläufern, die die zahl neuronalen Population in der darstellen wirderwachsenen Kleinhirn 9. Nach rostral Migration, begnügen sie sich in der Kleinhirn-anlage. Hier Mitose Granulat Neuron Vorstufen führt zu der dramatischen Expansion der äußeren Körnerschicht (EGL), die postnatal Ort bei Nagetieren dauert. Von der EGL, starten Neuronen nach innen durch die Migration der Molekularschicht (ML), vorbei an der Purkinje-Zellschicht, um letztendlich ihren Wohnsitz in der internen Körnerschicht (IGL 2). Während dieser Migrationsprozess, eine bipolare Form erwerben sie mit zwei Axone in die ML erstreckt. Beim weiteren Migration der Zellkörper wandert von den Axonen und die beiden Prozesse zu verschmelzen, um eine gabelförmige, T-förmige Axon 10 zu bilden. Anschließend wird diese Axone fasciculate und werden als parallele Fasern bezeichnet. Nachdem in der IGL siedelt, CGN wachsen Dendriten, die dendritischen Klauen bilden Synapsen mit Moosfasern herzustellen. Um grundlegende Prozesse in der Entwicklung von Kleinhirn zu untersuchen, ein in vitro und in vivo approac kombinierth ermöglicht zuverlässige Ergebnisse und Schlussfolgerungen.
CGN sind nicht nur die zahlreichen Nervenzellen des Kleinhirns, sondern des gesamten Gehirns und kultiviert, um die hohe Reinheit von 11 bis 13 sein. In der Kultur, wird diese sehr homogene neuronalen Population schnell postmitotische und erwirbt eine polare Morphologie mit leicht identifizierbaren Axonen und Dendriten. Kultivierte, CGN haben sich als äußerst nützlich, um verschiedene Aspekte der neuronalen Entwicklung einschließlich Vorläufer Proliferation, Differenzierung und axonalen Dendriten Entwicklung, neuronale Migration, Apoptose und elektrophysiologischen Eigenschaften (14-19 und viele andere) zu studieren sein. Die Nutzung genetischer Manipulation hat die Vielseitigkeit des kultivierten, CGN erweitert und für weitere mechanistische Einblicke in die genannten Veranstaltungen erlaubt. Transfektion von kultivierten Neuronen mit niedrigem Wirkungsgrad Calciumphosphat oder lipophile Methoden gefolgt von Immunzytochemie mit Polaritätsmarkierungen oder softwaregestützte Analyse FaciliTAATEN die Beurteilung zB der Morphologie der einzelnen Neuronen in einem neuronalen dichten Kultur. Mit diesem Ansatz kann die Rolle der Proteine von Interesse in Axon oder Dendritenwachstum 20-25,26-28 sucht werden. Das Kultursystem ist jedoch weniger nützlich, um neuronale Migration zu analysieren, wie die Migration in sehr hoher Dichte Kulturen begrenzt und würden Cokulturen erfordern. Die in vitro-Analyse von Axons und Dendriten-Wachstum ermöglicht auch die Prüfung von miteinander verbundenen Proteine eines Signalweges unter Verwendung von Kombinationen der RNA-Interferenz (I), Überexpression oder kleine Moleküle.
Um die Bedeutung des Proteins von Interesse in Axon und Dendriten Wachstumsregulierung oder neuronale Migration zu schaffen, ermöglicht die Analyse der Entwicklung von Kleinhirnrinde der in-vivo-Elektroporation (IVE)-Technik. Aufgrund der Tatsache, dass Kleinhirnentwicklung bei Nagetieren verlängert Weg in den ersten zwei Lebenswochen, das Kleinhirn stellt eine accessible Hirnstruktur für genetische Manipulationen zu untersuchen, entwickeln Axone und Dendriten, neuronale Migration, Synaptogenese und Apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. Darüber hinaus ist auch in diesem Modellsystem auch für andere Aspekte der neuronalen Entwicklung, die die intakte Kleinhirnrinde wie Axon Pathfinding, Verkabelung und Vernetzung der Neuronen und Glia-Neuron-Interaktionen Zusammengenommen benötigen, bietet dieses Protokoll in vitro und in-vivo-Techniken zur Bewältigung ein komplementärer Ansatz für die neuronalen Morphogenese und Migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorteile und Grenzen der in vitro-und in vivo-Methoden beschrieben:
Kultivierte, CGN von Maus und Ratte sind gleich gut für die morphologische Analysen geeignet. Aufgrund der größeren Größe eines Rattenkleinhirn, die Ausbeute von CNG aus Rattenjungen übersteigt die Maus Welpen 3-4x. Abgesehen von CGN kann kortikalen und hippocampalen Neuronen als Kultursystem verwendet, sowie werden. Das Calciumphosphat-Verfahren führt zu einer niedrigen (0,01-5%) Transfektionseffizienz, die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken N. Schwedhelm-Domeyer für hervorragende technische Unterstützung, C. und S. Hammer Papiol für die Hilfe bei statistischen Analysen. Unsere Arbeit wird von der Max-Planck-Gesellschaft, der Deutschen Forschungsgemeinschaft, dem Center for Nanoscale Mikroskopie und Molekularphysiologie des Gehirns (CNMPB), Göttingen, Deutschland und der Junior-Gruppe GGNB Stipendium von der Universität Göttingen finanziert.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
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