La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em> In Vitro</em> Y<em> En Vivo</em> Estudiar Neuronal Morfología y Migración
Summary
Morfogénesis neuronal y la migración son eventos cruciales que subyacen el desarrollo adecuado del cerebro. Aquí se describen los métodos para manipular genéticamente las neuronas granulares de cerebelo en cultivo y el cerebelo en desarrollo para la evaluación de la morfología y las características migratorias de las neuronas.
Abstract
Eventos de desarrollo en el cerebro, incluyendo la morfogénesis neuronal y la migración son altamente orquestados procesos. In vitro e in vivo análisis permite una caracterización en profundidad para identificar las vías que participan en estos eventos. Neuronas granulares de cerebelo (CGCs) que se derivan de la cerebelo en desarrollo son un sistema modelo ideal que permite análisis morfológicos. Aquí se describe un método de cómo manipular genéticamente CGCs y cómo estudiar axono y dendritogénesis de las neuronas individuales. Con este método los efectos de la interferencia de ARN, la sobreexpresión o moléculas pequeñas se pueden comparar para controlar las neuronas. Además, la corteza cerebelosa roedor es un sistema de fácil acceso en vivo debido a su desarrollo postnatal predominante. También presentamos una técnica de electroporación en vivo para manipular genéticamente el cerebelo en desarrollo y describir posterior del cerebelo se analizan para evaluar la morfología neuronal unnd migración.
Introduction
El cerebelo es un excelente sistema para estudiar los mecanismos de crecimiento de los axones y la migración. El cerebelo ha sido objeto de estudios anatómicos desde los albores de la neurociencia 1. Microscopía moderna y las técnicas inmunohistoquímicas han expandido significativamente y perfeccionado los descubrimientos iniciales por Santiago Ramón y Cajal 2-4. La genética del ratón de los estudios moleculares descubrieron los factores de crecimiento y de transcripción esenciales en el control del desarrollo del cerebelo, lo que condujo a una mayor comprensión de los acontecimientos cruciales requeridos para el cableado adecuado de los diferentes tipos de neuronas, incluyendo las neuronas granulares de cerebelo (CGCs) 5-7.
El cerebelo es un derivado de rombómero 1 de la parte posterior del cerebro en desarrollo 8. El labio rómbica, que es parte del techo de la 4 ª ventrículo, da lugar a progenitores neuronales de gránulos cerebelosos, que constituirán la más numerosa población neuronal en elcerebelo adulto 9. A raíz de la migración rostral, se instalan en el esbozo del cerebelo. Aquí, la mitosis de precursores gránulo neuronas conduce a la dramática expansión de la capa granular externa (EGL), que tiene lugar después del nacimiento en roedores. Desde el EGL, las neuronas comienzan a migrar hacia el interior a través de la capa molecular (ML), más allá de la capa de células de Purkinje que tome en última instancia, la residencia en la capa granular interna (IGL 2). Durante este proceso migratorio, adquieren una forma bipolar con dos axones se extiende en el ML. Tras una posterior migración, el cuerpo de la célula migra lejos de los axones y los dos procesos se fusionan para formar un axón bifurcado, en forma de T 10. Posteriormente, estos axones fasciculada y se conocen como fibras paralelas. Habiéndose establecido en el IGL, CGCs crecen dendritas, que forman garras dendríticas para establecer sinapsis con las fibras musgosas. Para examinar los procesos fundamentales en el cerebelo en desarrollo, un combinado in vitro e in vivo approach permite obtener resultados fiables y conclusiones.
CGCs no sólo son las más numerosas neuronas del cerebelo, sino de todo el cerebro y pueden ser cultivadas a gran pureza 11-13. En la cultura, esta población neuronal altamente homogénea se convierte rápidamente postmitotic y adquiere una morfología polar con axones fácilmente identificables y dendritas. CGCs cultivadas han demostrado ser de gran utilidad para estudiar diversos aspectos del desarrollo neuronal, incluyendo la proliferación de progenitores, la diferenciación y el desarrollo axonal dendrita, la migración neuronal, la apoptosis y las propiedades electrofisiológicas (14-19 y muchos otros). El empleo de la manipulación genética ha ampliado la versatilidad de CGCs cultivadas y permitió una mayor comprensión mecanicista de los hechos mencionados. Transfección de neuronas cultivadas utilizando fosfato de calcio de baja eficiencia o métodos lipofílicas seguidos por inmunocitoquímica con marcadores de polaridad o software soportado análisis faciliTates la evaluación de, por ejemplo la morfología de las neuronas individuales en un denso cultivo neuronal. Con este enfoque, el papel de las proteínas de interés en axón o la dendrita de crecimiento puede ser estudiado 20-25,26-28. Este sistema de cultivo sin embargo es menos útil para analizar la migración neuronal como la migración es muy limitada en cultivos de alta densidad y requeriría cocultivos. El análisis in vitro de axón y el crecimiento de dendritas también permite el examen de las proteínas interconectados de una vía de señalización que utilizan combinaciones de interferencia de ARN (i), sobre-expresión o pequeñas moléculas.
Para establecer la relevancia de la proteína de interés en el axón y la regulación del crecimiento de dendritas o la migración neuronal, la electroporación in vivo técnica (IVE) permite el análisis en la corteza cerebelosa desarrollo. Debido al hecho de que el desarrollo del cerebelo en roedores se extiende camino en las dos primeras semanas después del parto, el cerebelo representa un accessibla estructura del cerebro le manipulaciones genéticas para examinar el desarrollo de los axones y dendritas, la migración neuronal, sinaptogénesis y apoptosis 20-24,29,30,26,27,31-34. Además, este sistema modelo es también útil para otros aspectos del desarrollo neuronal que requieren la corteza cerebelosa intacta como pathfinding axón, el cableado y la conectividad de las neuronas y de las interacciones neurona-glía Tomados en conjunto, este protocolo proporciona in vitro y en técnicas in vivo para hacer frente un enfoque complementario con respecto a la morfogénesis neuronal y la migración.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventajas y limitaciones de la descrita in vitro e in vivo:
CGCs cultivadas de ratón y ratas son igualmente aptas para los análisis morfológicos. Debido al tamaño más grande de un cerebelo de rata, el rendimiento de GCN de crías de rata que excede de crías de ratón 3-4x. Aparte de CGCs, las neuronas corticales y del hipocampo se pueden usar como sistema de cultivo así. El método de fosfato de calcio da como resultado un bajo (0,01-5%) eficiencia de transfección, q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a N. Schwedhelm-Domeyer por su excelente asistencia técnica, C. y S. Hammer Papiol ayuda con los análisis estadísticos. Nuestro trabajo es financiado por la Sociedad Max Planck, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, el Centro de Nanotecnología Microscopía y Fisiología Molecular del Cerebro (CNMPB), Göttingen, Alemania y por la GGNB Grupo Junior Mesada de la Universidad de Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
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