Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em> Экстракорпоральное</em> И<em> В Vivo</em> По изучению нейронных Морфология и миграция
Summary
Нейронов морфогенез и миграция являются важными события, лежащие в основе правильного развития мозга. Здесь мы описываем методы, чтобы генетически манипулировать культивируемые мозжечка гранул нейронов и развивающийся мозжечок для оценки морфологии и миграционных характеристик нейронов.
Abstract
Развивающие события в мозге в том числе нейронов формообразования и миграции высоко организованы процессы. В пробирке и в естественных анализирует позволяют для характеризации углубленного выявления путей, вовлеченных в эти события. Мозжечка гранул нейроны (КСГН), которые получены из развивающихся мозжечка являются идеальной моделью системы, которая позволяет морфологического анализа. Здесь мы опишем метод того, как генетически манипулировать КСГН и как учиться axono-и dendritogenesis отдельных нейронов. С помощью этого метода эффекты интерференции РНК, повышенной экспрессией или малых молекул может быть по сравнению с контрольными нейронов. Кроме того, грызун коры мозжечка является доступным в системе естественных условиях в связи с его преимущественным развитием послеродовой. Мы также представляем естественных условиях технику электропорации в генетически манипулировать развивающийся мозжечка и описать последующую мозжечка анализирует оценить нейронов морфологии Aй миграции.
Introduction
Мозжечок является отличной системой для изучения механизмов роста аксона и миграции. Мозжечок является предметом анатомических исследований с незапамятных неврологии 1. Современная микроскопия и иммуногистохимические методы значительно расширили и уточнили первоначальные открытия, Сантьяго, Рамон, и Cajal 2-4. Генетика мыши и молекулярные исследования обнаружили существенный рост и транскрипционных факторов в контроле развития мозжечка, что привело к большему пониманию важнейших событий, необходимых для правильного подключения различных типов нейронов в том числе мозжечка гранул нейронов (КСГН) 5-7.
Мозжечок является производным ромбомере 1 развивающегося заднего мозга 8. Ромбическая губа, которая является частью крыши 4-го желудочка, приводит к мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников, которые будут составлять самую многочисленную нейронов населения ввзрослых мозжечок 9. После ростральной миграции, они располагаются в коре зачатка. Здесь, митоз гранула нейронных предшественников приводит к резкому расширению внешнего зернистого слоя (EGL), который проходит после рождения у грызунов. Из EGL, нейроны начинают мигрировать внутрь через молекулярного слоя (ML), мимо слой клеток Пуркинье в конечном итоге поселяются во внутреннем зернистого слоя (IGL 2). Во время этого миграционного процесса, они приобретают биполярную форму с двумя аксоны, проходящий в ML. После дальнейшей миграции, тело клетки мигрируют от аксонов и эти два процесса сливаются, образуя один раздвоенный, Т-образные аксон 10. Впоследствии эти аксоны расположенный пучком и называются параллельными волокнами. Поселившись в IGL, КСГН расти дендриты, которые образуют дендритные когти установить синапсы с мшистых волокон. Чтобы исследовать фундаментальные процессы в развивающемся мозжечке, объединены в пробирке и в естественных условиях approacч позволяет надежных результатов и выводов.
КСГН не только самые многочисленные нейроны мозжечка, но из всей мозга и может быть культурным в высокой степени чистоты 11-13. В культуре, однако это весьма однородной нейронов население становится быстро постмитотическими и приобретает полярный морфологию с легко идентифицируемых аксонов и дендритов. Искусственный КСГН оказались чрезвычайно полезными для изучения различных аспектов развития нейронов включая пролиферацию предшественников, дифференциации аксонов и дендритов развития, миграции нейронов, апоптоз и электрофизиологических свойств (14-19 и многие другие). Использование генетических манипуляций расширила универсальность культивируемых КСГН и позволил для дальнейшего механистического понимания вышеупомянутых событий. Трансфекция культивируемых нейронов использованием низким кпд фосфат кальция или липофильные методы следуют иммуноцитохимии с полярностью маркеров или программного обеспечения при поддержке анализа FaciliTates оценку например морфологии отдельных нейронов в плотной нейронов культуры. При таком подходе роль представляющих интерес белков в аксонов или дендритов роста могут быть изучены 20-25,26-28. Эта система культуры, однако, менее полезны для анализа миграцию нейронов, как миграция очень ограничена в культурах с высокой плотностью и потребует совместных культурах. Анализ в пробирке аксона и роста дендритов также позволяет рассмотрении взаимосвязанных белков сигнального пути с использованием комбинации РНК-интерференция (I), сверхэкспрессии или малых молекул.
Для установления актуальность интересующего белка в аксона и регуляции роста дендритов или миграции нейронов, электропорации в естественных условиях (IVE) метод позволяет для анализа в развивающихся коры мозжечка. Благодаря тому, что мозжечковая развитие у грызунов проходит путь в первых двух недель постнатального, мозжечок представляет собой accessibструктура мозга ле для генетических манипуляций с целью рассмотрения развития аксонов и дендритов, миграцию нейронов, синаптогенез и апоптоз 20-24,29,30,26,27,31-34. Кроме того, эта модель системы также полезно для других аспектов развития нейронов, которые требуют неповрежденную коры мозжечка например аксона поиска пути, проводки и подключения нейронов и нейронов-глии взаимодействий, вместе взятых, этот протокол обеспечивает в пробирке и в естественных условиях методы для решения дополнительный подход в отношении нейронов формообразования и миграции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества и ограничения описаны в пробирке и в естественных условиях методов:
Искусственный КСГН от мыши и крысы одинаково хорошо подходит для морфологического анализа. В связи с большим размером мозжечка крыс, выход АГНКС от крысят превышает щенков мыши 3-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Н. Schwedhelm-Domeyer за отличную техническую помощь, С. Серп и С. Papiol за помощь в статистическом анализе. Наша работа финансируется за счет Общества Макса Планка, в Deutsche Forschungsgemeinschaft, Центра наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии головного мозга (CNMPB), Геттингене, Германия и по GGNB младшая группа стипендию в Геттингенском университете.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
- Cajal, S. R. . Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , 419-41 .
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
