Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie
Summary
Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) ist die aggressivste Form von Hirntumoren ohne heilende Behandlungen zur Verfügung zu halten.
Murine Modelle dieser Pathologie beruhen auf der Injektion einer Suspension von Gliomzellen in das Hirnparenchym nach Inzision der Dura mater. Während die Zellen oberflächlich injiziert zugänglich Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie zu sein, oberflächliche Injektionen nicht den pathophysiologischen Bedingungen zu rekapitulieren. In der Tat, auf der Flucht durch die Einspritztrakt meisten Tumorzellen zu erreichen, die extra-duralen Raum, wo sie in Abwesenheit von mechanischen Einschränkungen von Parenchym ungewöhnlich schnell zu erweitern.
Unsere Verbesserungen bestehen nicht nur in der fokal Implantieren eines Gliom Sphäroid anstatt Injizieren einer Suspension von Gliomzellen in den oberflächlichen Schichten der Hirnrinde, sondern auch ein Verstopfen der Injektionsstelle von einem vernetzten Dextran-Gel, halb Wulst, die zu der Umge geklebtding Parenchym und Dura mater mit Sekundenkleber verschlossen. Insgesamt sind diese Maßnahmen durchzusetzen, die physiologische Ausdehnung und Infiltration der Tumorzellen innerhalb der Hirnparenchym. Kraniotomie wurde schließlich geschlossen mit ein Glasfenster zementiert auf den Schädel, um chronische Bildgebung über Wochen in Abwesenheit von Narbengewebe Entwicklung zu ermöglichen.
Unter Ausnutzung der Fluoreszenz-transgene Tiere mit fluoreszierenden Tumorzellen haben wir gezeigt, dass die Dynamik der Wechselwirkungen zwischen Gliomzellen, Neuronen (z. B. Thy1-GFP-Mäuse) und Gefäßen (durch eine intravenöse Injektion eines fluoreszierenden Farbstoff markiert) auftreten, können durch intravitalen visualisiert gepfropften Zwei-Photonen-Mikroskopie während des Fortschreitens der Erkrankung.
Die Möglichkeit, Bild ein Tumor in mikroskopischer Auflösung in einem minimal beeinträchtigt Hirn Umwelt stellt eine Verbesserung der derzeitigen GBM Tiermodellen, die den Bereich der Neuro-Onkologie-und Drogentests profitieren sollte. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme erscheint als die aggressivste Form von Hirntumoren bei Erwachsenen mit einer medianen Überlebens von 12 Monaten und einer 5-Jahres-Überlebensrate von 5%. Clinical Management setzt auf Operation, Bestrahlung und Chemotherapie häufig in Kombination verwendet. Die Wirkungen dieser Behandlungen bleiben jedoch palliative 1-3.
Bis heute basieren die meisten neuro onkologischen Studien über Verfahren, die nur in der Lage sind, ein statisches Bild vermittelt und auf großen Kohorten von Tumor-tragenden Tieren durchgeführt geopfert zu verschiedenen Zeitpunkten (siehe beispielsweise 4,5). Die jüngste Entwicklung der Folgeverfahren, die auf intravitalen Bildgebung ermöglicht das Studium Gliom Wachstum und die Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung pathophysiologischen auf demselben Tier im Laufe der Zeit. Dies eröffnet den Weg zu exklusiven Stück von Informationen, die bisher unerreichbar war 6. Transgene Tiere ausdrücken fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse sein können aufd die spezifische Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und zB Neuronen in diesem Papier zu studieren.
Während des letzten Jahrzehnts, Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie 7 hat sich zu einem Standard in der Grundneuroonkologie Studien und präklinischen Studien 8,9 für seine Fähigkeit, tief Intravital Beobachtung Gehirn der Maus durchführen (> 500 um unter die Dura mater) mit eine mikrometrischen räumlichen Auflösung 10. Mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie mit orthotopical Tiermodellen mit einer chronischen Hirn Fenster 11 implantiert, ist es möglich, die Tumorprogression im Laufe der Zeit auf der gleichen Maus 9,12 folgen.
Einer der Hauptnachteile dieser vorveröffentlichten Tiermodell ist jedoch, daß sie die physikalischen Beschränkungen, die das Tumorwachstum regeln, die Dura mater wird nicht nach der Injektion der Zellsuspension 9,13,14 abgedichtet nicht nachahmen müssen. Gliom-Zellen können in der Leckextraduralen Raum Transformation eines orthotopen Gliom-Modell in eine heterotope ein.
Das Tiermodell hier dargestellt, besteht in der Injektion eines Sphäroids fluoreszierender Gliomzellen in der Hirnrinde bei einer Tiefe von 200 &mgr; m, gefolgt von der Abdichtung der Dura mater mit einer vernetzten Dextran-Gel-hemi-Wulst und histo-kompatible Kleber . Das Tumorwachstum wird dann in das Hirnparenchym, die pathophysiologischen physikalischen Beschränkungen hält beschränkt. Eine chronische Glasfenster über dem Tumor implantiert ermöglicht einen einfachen optischen Zugang für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie. Mit transgenen Tiere exprimieren fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse ist es möglich, ein Follow-up der Gliom-Wachstum im Laufe der Zeit durchzuführen und seine Interaktion mit seiner Mikroumgebung (hier mit Neuronen und Gefäßsystem mit fluoreszierenden Dextranen hervorgehoben) zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Ansatz ermöglicht die Verwendung von optischen bildgebenden Verfahren zu überwachen, über Tage und Wochen das Wachstum einer orthotop Gliom implantiert. Das gleiche Tier kann anschließend im Verlauf der Pathologie zu praktisch jeder Hirnbildgebungsverfahren unterzogen werden; noch die Zwei-Photonen-Mikroskopie spezifische Vorbereitung bietet die einmalige Gelegenheit, subzellulärer Auflösung im Gehirn des lebenden Tieres zu erreichen. Unser Protokoll bietet den Vorteil, das Tumorwachstum in Hirngewebe und n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren herzlich danken Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. und A. Weber Jaouen für hilfreiche Diskussionen; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, die Mitarbeiter der Tierhaltung bei IBDML und das Personal der PicSIL Imaging-Plattform an IBDML für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) an GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche unterstützt sur le Cerveau (FRC) auf FD, durch Stipendien von der Fédération de la Recherche Médicale und Cancéropôle PACA CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
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