Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital
Summary
הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.
Abstract
multiforme glioblastoma (GBM) הוא הצורה האגרסיבית ביותר של גידולים במוח ללא טיפולים מרפאים זמינים עד כה.
מודלים Murine של פתולוגיה זו מסתמכים על הזריקה של השעיה של תאי גליומה לתוך המוח parenchyma הבא חתך של הדורה-מאטר. ואילו התאים צריכים להיות מוזרקים באופן שטחי להיות נגיש לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital, זריקות שטחיות לא מצליחות לשחזר את תנאי physiopathological. ואכן, שנמלט דרך מערכת ההזרקה רוב התאים הסרטניים מגיעים לשטח הנוסף, שבו הם dural להרחיב מהירים באופן חריג בהעדר אילוצים מכאניים מparenchyma.
השיפורים שלנו מורכבים לא רק בfocally השתלה אליפטית גליומה במקום הזרקת השעיה של תאי גליומה בשכבות השטחיות של קליפת המוח, אלא גם בסתימת אתר ההזרקה על ידי חמי חרוז ג'ל dextran צולבים כי הוא דבוק לsurrounparenchyma דינג ואטום לדורה מאטר-עם cyanoacrylate. בסך הכל אמצעים אלה לאכוף את הרחבה וחדירה הפיזיולוגיות של התאים הסרטניים בתוך parenchyma המוח. Craniotomy סופו של דבר סגרה עם חלון זכוכית ביצרו לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות בהעדר התפתחות רקמת צלקת.
ניצול של בעלי חיים מהונדסים ניאון מורכב עם תאים סרטניים ניאון שהראינו שהדינמיקה של אינטראקציות המתרחשות בין תאי גליומה, תאי עצב (למשל עכברי Thy1-CFP) וכלי דם (מודגש על ידי הזרקה תוך ורידית של צבע פלואורסצנטי) ניתן דמיינו ידי intravital שני פוטונים במיקרוסקופ במהלך ההתקדמות של המחלה.
האפשרות לתמונה ברזולוציה גידול מיקרוסקופית בסביבת מוחין בסכנה מינימאלית מהווה שיפור של מודלים של בעלי החיים GBM הנוכחיים שאמור להועיל לתחום נוירו אונקולוגיה ובדיקות סמים. </p>
Introduction
multiforme glioblastoma מופיע כצורה האגרסיבית ביותר של גידול במוח במבוגרים עם חציון הישרדות של 12 חודשים ושיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 5%. ניהול קליני מסתמך על ניתוח, הקרנות וכימותרפיה משמשת לעתים קרובות בשילוב. עם זאת, ההשפעות של טיפולים אלה יישארו פליאטיבי 1-3.
עד כה, רוב מחקרי נוירו אונקולוגיה מסתמכים על טכניקות כי הם רק מסוגלים לספק תצוגה סטטית ובוצעו על קבוצות גדולות של בעלי חיים הנושאים גידול הקריבו בזמן נקודות שונות (ראה, למשל, 4,5). הפיתוח האחרון של שיטות מעקב המבוססים על ההדמיה intravital מאפשר לימוד צמיחת גליומה ויחסי הגומלין בין תאים סרטניים והמיקרו pathophysiological על אותו בעלי החיים לאורך זמן. זו פותחת את הדרך ליצירה בלעדית של מידע שהייתה בלתי ניתן להשגה עד כה 6. בעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין עשויים להיות שימושד ללמוד אינטראקציות ספציפיות בין תאים סרטניים ותאי עצב לדוגמא במאמר זה.
במהלך העשור האחרון, שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital 7 הפך לסטנדרטי במחקרי נוירו אונקולוגיה בסיסיים וניסויים פרה 8,9 ביכולתה לבצע תצפית intravital עמוקה של מוח עכבר זהב (> 500 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-) עם רזולוציה מרחבית micrometric 10. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים intravital עם מודלים של בעלי החיים orthotopical המושתלים עם חלון גולגולתי כרוני 11, ניתן לעקוב אחר התקדמות גידול לאורך זמן באותו 9,12 עכבר.
אחד החסרונות העיקריים של מודלים של בעלי החיים שפורסמו בעבר אלה הוא, עם זאת, הם לא מחקים את המגבלות פיזיות הקובעים את צמיחת גידול כדורה מאטר, אינו אטום לאחר ההזרקה של ההשעיה תא 9,13,14. תאי גליומה עלולים לדלוף בחלל extradural הפיכת מודל גליומה orthotopic לאחד heterotopic.
מודל החיה המוצג כאן מורכב בהזרקה של אליפטית של תאי גליומה ניאון בקליפת המוח בעומק של 200 מיקרומטר ואחרי האיטום של הדורה מאטר, עם ג'ל, חמי חרוז dextran צולבים ודבק histo התואם . צמיחת הגידול מכן הוגבלה לparenchyma המוח ששומר על מגבלות פיזיות pathophysiological. חלון זכוכית כרונית המושתל מעל לגידול מאפשר גישה אופטית קלה עבור שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital. שימוש בבעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין זה ניתן לבצע מעקב של צמיחת גליומה לאורך זמן וללמוד את האינטראקציה שלה עם microenvironment (כאן עם נוירונים וכלי דם מודגשים עם dextrans ניאון).
Protocol
Representative Results
Discussion
גישה זו מאפשרת השימוש בשיטות הדמיה אופטיות כדי לפקח על ימים ושבועות הצמיחה של גליומה המושתלת orthotopically. בעלי החיים זהים בהמשך יכולים להיות נתונה לכמעט כל שיטת הדמיה מוחית במהלך הפתולוגיה; עדיין ההכנה הספציפית במיקרוסקופ שני פוטונים מציעה הזדמנות הייחודית להשיג רזולו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים בחום מודים לד"ר KK Fenrich, ד"ר MC. Amoureux, פ וובר וא 'Jaouen לדיונים מועילים; מ 'Hocine, ג Meunier, מ' Metwaly, ס 'Bensemmane, J. Bonnardel, צוות של מתקן בעלי החיים בIBDML וצוות של פלטפורמת ההדמיה PicSIL בIBDML לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי du הסרטן (האינקה-DGOS-INSERM6038) לGR, סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), הפדרציה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le Cerveau (FRC) לFD, על ידי מלגות מהפדרציה דה לה משוכלל ונדיר Médicale וCancéropole PACA לCR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
