Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia
Summary
Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) è la forma più aggressiva di tumore cerebrale senza trattamenti curativi ad oggi disponibili.
Modelli murini di questa patologia basano sull'iniezione di una sospensione di cellule di glioma nel parenchima cerebrale dopo incisione della dura madre. Considerando che le cellule devono essere iniettato superficialmente per essere accessibile a intravital microscopia a due fotoni, iniezioni superficiali non riescono a riepilogare le condizioni fisiopatologiche. Infatti, in fuga attraverso il tratto di iniezione maggior parte delle cellule tumorali raggiungono lo spazio extra-durale dove si espandono eccessivamente veloce, in assenza di vincoli meccanici del parenchima.
I nostri miglioramenti consistono non solo in focally impiantare uno sferoide glioma piuttosto che iniettare una sospensione di cellule di glioma negli strati superficiali della corteccia cerebrale, ma anche in intasamento sito di iniezione da un destrano gel emi-bead reticolato che è incollato alla cirding parenchima e sigillato a dura madre con cianoacrilato. Complessivamente queste misure rispettare la fisiologica espansione e l'infiltrazione delle cellule tumorali all'interno del parenchima cerebrale. Craniotomia è stato finalmente chiuso con una finestra di vetro cementato al cranio per consentire l'imaging cronica nel corso di settimane, in assenza di sviluppo del tessuto cicatriziale.
Approfittando di animali transgenici fluorescenti innestate con cellule tumorali fluorescenti Abbiamo dimostrato che le dinamiche di interazioni che avvengono tra le cellule del glioma, i neuroni (ad es Thy1-CFP topi) e vascolare (evidenziato da una iniezione endovenosa di un colorante fluorescente) possono essere visualizzati da intravital microscopia a due fotoni durante la progressione della malattia.
La possibilità di un tumore immagine a risoluzione microscopica in un ambiente cerebrale minimamente compromesso rappresenta un miglioramento degli attuali modelli animali di GBM che dovrebbero beneficiare campo della neuro-oncologia e test anti-droga. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme appare come la forma più aggressiva di tumore cerebrale negli adulti con una sopravvivenza mediana di 12 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza del 5%. Gestione clinica si basa sulla chirurgia, radioterapia e chemioterapia spesso usati in combinazione. Tuttavia, gli effetti di questi trattamenti rimangono palliative 1-3.
Fino ad ora, la maggior parte degli studi neuro-oncologia si basano su tecniche che sono solo in grado di fornire una visione statica ed eseguiti su grandi coorti di tumore animali recanti sacrificati a diversi punti temporali (si veda ad esempio 4,5). Il recente sviluppo di metodi di follow-up sulla base di imaging intravitale consente di studiare la crescita del glioma e le interazioni tra cellule tumorali e il loro microambiente fisiopatologica sullo stesso animale nel corso del tempo. Questo apre la strada per pezzo esclusivo di informazione che è stato finora irrealizzabile 6. Gli animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse possono essere utilizzatid per studiare le interazioni specifiche tra le cellule tumorali e ad esempio i neuroni in questo documento.
Negli ultimi dieci anni, intravital microscopia a due fotoni 7 è diventato un gold standard negli studi di neuro-oncologia fondamentali e sperimentazioni precliniche 8,9 per la sua capacità di eseguire profonda osservazione intravital di cervello di topo (> 500 micron al di sotto della dura madre) con una risoluzione spaziale micrometrica 10. Uso intravital microscopia a due fotoni con modelli animali orthotopical impiantati con una finestra cranica cronica 11, è possibile seguire la progressione tumorale nel tempo sulla stessa 9,12 mouse.
Uno dei principali inconvenienti di questi modelli animali precedentemente pubblicati è tuttavia che non imitano i vincoli fisici che regolano la crescita tumorale come la dura madre non è sigillato dopo l'iniezione della sospensione cellulare 9,13,14. Cellule del glioma possono perdere inspazio extradurale trasformazione di un modello di glioma ortotopico in uno eterotopico.
Il modello animale qui presentato consiste nella iniezione di uno sferoide di cellule di glioma fluorescenti nella corteccia cerebrale ad una profondità di 200 micron seguita dalla sigillatura della dura madre con destrano gel emi-bead reticolato e colla compatibile isto . La crescita tumorale è poi limitato al parenchima cerebrale che mantiene vincoli fisici patofisiologici. Una finestra di vetro cronica impiantato al di sopra del tumore consente un accesso ottico facile per intravital microscopia a due fotoni. L'uso di animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse è possibile eseguire un follow-up della crescita glioma nel tempo e per studiare la sua interazione con il suo microambiente (qui con neuroni e vasi evidenziati con destrani fluorescenti).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo approccio consente l'uso di metodi di imaging ottico per monitorare per giorni e settimane la crescita di un glioma ortotopicamente impiantato. Lo stesso animale può successivamente essere sottoposto a qualsiasi modalità di imaging cerebrale durante il corso della patologia; eppure la preparazione specifica microscopia a due fotoni offre l'opportunità unica di ottenere una risoluzione subcellulare all'interno del cervello dell'animale vivente. Il nostro protocollo presenta il vantaggio di far r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano sentitamente il Dott. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber e A. Jaouen per voti discussioni; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, il personale della struttura animale in IBDML e il personale della piattaforma di imaging PicSIL a IBDML per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) per FD, per borse di studio dalla Fédération de la Recherche Médicale e Cancéropôle PACA alla CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
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