Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel
Summary
Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.
Abstract
De overdracht van implantatie embryo's een vrouwelijke surrogaat is een verplichte stap voor de productie van genetisch gemodificeerde muizen of onderzoeken de effecten van epigenetische veranderingen ontstaan tijdens de pre-implantatie ontwikkeling op latere foetale en volwassen gezondheid. Het gebruik van een effectieve en consistente embryo transfer techniek is cruciaal voor het genereren van genetisch gemodificeerde dieren verbeteren en het effect van verschillende behandelingen inplantingstarieven en overleving termijn bepalen. Embryo's in het blastocyst stadium worden meestal overgedragen door baarmoeder overdracht, het uitvoeren van een lek in de baarmoederwand aan de embryomanipulatie pipet introduceren. De opening uitgevoerd in de baarmoeder niet gesloten nadat de pipet is ingetrokken en de embryo kan uitstroom naar de buikholte door de positieve druk van de baarmoeder. De punctie kan produceren ook een bloeding die implantatie schaadt, blokkeert de overdracht pipet en van invloed kunnen embryo development, vooral wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen. Bijgevolg, deze techniek resulteert vaak in zeer variabel en algehele lage embryo overleving. Het vermijden van deze negatieve effecten, baarmoeder-eileiders embryotransplantatie profiteren van de utero-eileiders splitsing als een natuurlijke barrière die embryo uitstroom belemmert en te voorkomen dat de punctie van de baarmoederwand. Vasectomized mannetjes zijn vereist voor het verkrijgen van pseudo-ontvangers. Een techniek om vasectomie uitvoeren wordt beschreven als een aanvulling op de utero-eileiders embryo transfer.
Introduction
Embryo overdracht is waarschijnlijk de meest voorkomende chirurgische ingreep in het muismodel. Deze techniek is essentieel om nakomelingen te verkrijgen van embryo's die in vitro manipulatie technieken en derhalve een noodzakelijke stap voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde modellen van pronucleaire injectie, lentivirale transductie of chimeer vorming. Bovendien, de techniek kan de studie van de ontwikkeling van diverse effecten beledigingen die tijdens pre-implantatie ontwikkeling. Het gebruik van kunstmatige voortplantingstechnieken 1 of blootstelling aan abnormale concentraties van verschillende stoffen of metabolieten mei 2 embryoontwikkeling waardoor implantatie of placentatie storingen en de nakomelingen lange termijn beïnvloeden. Een betrouwbare en reproduceerbare embryo transfer techniek is cruciaal om de mogelijke negatieve effecten van de experimentele behandeling op de implantatie en de foetale ontwikkeling op een consistente man te testenner.
Muizen-implantatie embryo's kan worden overgedragen aan een ontvanger vrouwelijke ofwel in de eileider via de ampullen van 0,5 dagen na de coïtus (dpc) pseudozwanger ontvangers (eileider transfer) 3,4 of in de baarmoeder van 2,5 dpc pseudozwangere ontvanger (baarmoeder transfer) 5,6 Afhankelijk van hun ontwikkelingsfase. Embryo's in het blastocyst stadium, zoals die chimere muizen te genereren door injectie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, wordt normaliter door baarmoeder overdracht. Blastocysten kunnen ook worden overgedragen aan de eileider van een 0,5 dpc ontvanger, maar het vormt een minder fysiologische test voor ontwikkelingsstoornissen verstoorders, omdat het embryo ondergaat diapause en heeft 2 dagen om te herstellen van de belediging voor implantatie plaatsvindt. Baarmoeder overdracht omvat aanprikken van de baarmoederwand met een smalle naald teneinde een opening die de toegang van een embryo manipulatie pipet kan in de baarmoeder lumen genereren. Eenoewel deze techniek kan goede resultaten opleveren, de overleving termijn (dwz het percentage van embryo's die zich ontwikkelen naar een pup) is vaak laag en onvoorspelbaar 7,8.
De punctie van de baarmoederwand is evenwel niet zonder schadelijke bijwerkingen. Eerst myometrium is een zeer gevasculariseerde weefsels en de punctie resulteert vaak in een kleine bloeding. Bloed kan de embryo transfer pipet blokkeren of binnenvallen de baarmoeder lumen waardoor embryonale sterfte en / of implantatie mislukking. Dit is met name relevant wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen, als de bloedcellen en vuil kan hechten aan de blastomeren. Ten tweede, heeft de opening verricht niet dichten nadat de embryo's zijn overgebracht, zodat ze terug kan stromen door de opening en worden uitgezet naar de buikholte wanneer een te groot volume is te introduceren in de baarmoeder. De baarmoeder-eileiders embryotransplantatie hierin beschreven profiteren van de utero-eileiders afslag naar de embr leverenyos in de baarmoeder zonder prikken de baarmoederwand en aldus voorkomen de nadelige gevolgen 9.
De pseudo-ontvanger vrouwtjes gebruikt voor embryotransplantatie worden verkregen door natuurlijke bevruchting met vasectomized mannetjes 8. Het rudimentaire afscheidingen door een steriele mannelijke vereist de baarmoeder ontvankelijk voor de overgebrachte embryo worden. Om een ontvanger te krijgen, maximaal 2 teefjes van 8 weken tot 6 maanden oud zijn ondergebracht bij een vasectomie mannelijke in de middag. De volgende ochtend, het koeien gecontroleerd op de aanwezigheid van een vaginale copulatie stekker, een klomp van gestolde eiwitten van de mannelijke zaadvloeistof. Als paring komt gewoonlijk tijdens middernacht, wordt de dag van de vaginale plug detectie beschouwd 0,5 dpc. Hoewel vasectomie mannetjes kunnen worden gekocht bij een aantal leveranciers, de hierin beschreven chirurgische procedure is relatief eenvoudig en vereist geen extra instrumenten nodig dan vereist voor embryotransfer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vasectomie is een relatief ongecompliceerd chirurgische techniek die grote moeilijkheden geen sprake. Bij het opschonen met povidonjood en ethanol ervoor te zorgen dat de laatste wasbeurt (met ethanol) verwijdert povidonjood, omdat het het buikvlies kan irriteren. De toegang tot zaadleider kan ook worden bereikt door het scrotum of het uitvoeren van een transversale incisie in de buik 8. Scrotum incisie is aanbevolen om buikinsnijding transversale te wijten aan de relatief kleinere incisie nodig is e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Vakgroep Dierlijke en Avian Sciences aan BT.
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
References
- Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
- Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
- Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
- Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
- McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
- McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
- Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
- Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
- Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
- Flecknell, P. A. . Laboratory Animal Anaesthesia. , (2009).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
- Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
- Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
- Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
- Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
- Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
- Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
- Dios Hourcade, d. e., Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A, B., Pintado, In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).
