Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

Summary

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Abstract

A transferência de embriões pré-implantação de uma fêmea de aluguel é um passo necessário para a produção de ratos geneticamente modificados ou para estudar os efeitos das alterações epigenéticas originou durante o desenvolvimento pré-implantação em desenvolvimento e adulto fetal subseqüente saúde. A utilização de uma técnica de transferência de embriões eficaz e consistente é importante para aumentar a geração de animais geneticamente modificados e para determinar o efeito de diferentes tratamentos sobre as taxas de implantação e sobrevivência a termo. Embriões no estádio de blastocisto são normalmente transferidos por transferência uterina, realizando um furo na parede uterina para introduzir a pipeta de manipulação de embriões. O orifício realizado no útero não fechar após a pipeta foi retirada, e os embriões podem saída para a cavidade abdominal devido à pressão positiva do útero. A punção também pode produzir uma hemorragia que prejudica a implantação, bloqueia a pipeta de transferência e pode afetar o embrião development, especialmente quando os embriões são transferidos sem zona. Consequentemente, esta técnica muitas vezes resulta em taxas de sobrevivência de embriões de baixa muito variáveis, e em geral. Evitar estes efeitos negativos, transferência de embrião tubário utero-aproveitar a junção útero-tubária como uma barreira natural que impede a saída do embrião e evitar a perfuração da parede uterina. Machos vasectomizados são necessários para a obtenção de destinatários pseudográvidas. Uma técnica para realizar a vasectomia é descrito como um complemento para a transferência de embriões útero-tubária.

Introduction

A transferência de embriões é provavelmente o procedimento cirúrgico mais realizado no modelo de mouse. Esta técnica é essencial para a obtenção de descendentes de embriões sujeitos a técnicas de manipulação in vitro e, por conseguinte, constitui um passo necessário para o desenvolvimento de modelos geneticamente modificadas através de injecção pronuclear, a transdução lentiviral, ou a formação de quimeras. Além disso, a técnica permite o estudo dos efeitos sobre o desenvolvimento de diversos insultos que ocorrem durante o desenvolvimento pré-implantação. O uso de técnicas de reprodução artificial ¹ ou a exposição a concentrações anormais de diferentes substâncias ou metabólitos ^{02 de maio} afetar o desenvolvimento do embrião, resultando em falhas de implantação ou de placentação e efeitos a longo prazo na prole. A técnica de transferência de embriões confiável e reprodutível é crucial para testar os possíveis efeitos negativos do tratamento experimental na implantação e desenvolvimento fetal em um homem consistentener.

Embriões de pré-implantação de murino pode ser transferido para uma fêmea receptora, quer para o oviduto através da ampola de 0,5 dias post coitum (DPC) destinatários pseudográvidas (transferência oviduto ^3,4) ou no útero de 2,5 dpc pseudo-destinatário (transferência uterina) ^5,6 dependendo do seu estágio de desenvolvimento. Os embriões na fase de blastocisto, tal como aqueles utilizados para gerar ratinhos quiméricos através da injecção de células estaminais embrionárias pluripotentes ou induzidos, são usualmente transferidas por transferência uterina. Blastocistos pode também ser transferido para o oviducto de um recipiente de 0,5 dpc, mas constitui um teste menos fisiológico para disruptores de desenvolvimento, porque o embrião sofre diapausa e tem 2 dias para se recuperar a partir do insulto antes da implantação ocorra. Transferência uterina envolve perfurar a parede uterina com uma agulha fina, a fim de gerar uma abertura que permite o acesso de uma pipeta de manipulação do embrião no lúmen uterino. Ambora esta técnica pode produzir bons resultados, a sobrevivência a prazo (ou seja, a percentagem de embriões transferidos que se desenvolvem a um filhote de cachorro) é geralmente baixa e imprevisível ^7,8.

O punção da parede uterina implica alguns efeitos secundários prejudiciais. Em primeiro lugar, o miométrio é um tecido altamente vascularizado e seu punção muitas vezes resulta em uma pequena hemorragia. O sangue pode bloquear a pipeta de transferência de embriões ou invadir o lúmen do útero causando a morte embrionária e / ou falhas de implantação. Isto é particularmente relevante quando os embriões são transferidos sem zona, como as células do sangue e detritos pode anexar os blastômeros. Em segundo lugar, a abertura realizada não vedar depois os embriões foram transferidos, de modo que possa fluir para trás através do orifício e ser expulso para a cavidade abdominal, quando uma muito grande volume foi introduzir no útero. A transferência do embrião útero-tubária aqui descritas tomar vantagem da junção útero-tubária para entregar o embryos no útero, sem a necessidade de perfurar a parede uterina e assim evitar as suas consequências adversas ^9.

As fêmeas receptoras pseudográvidas utilizados para transferência de embriões são obtidos por monta natural com machos vasectomizados ^8. As secreções seminais produzidos por um macho estéril, que são necessários para o útero para se tornar receptivo para os embriões transferidos. Para obter um recipiente, um máximo de duas fêmeas de 8 semanas a 6 meses de idade, são colocados com um macho vasectomizado na parte da tarde. Na manhã seguinte, as fêmeas são verificadas quanto a presença de um tampão de cópula vaginal, um grupo de proteínas coaguladas do fluido seminal masculino. Como acasalamento ocorre geralmente durante a meia-noite, o dia de detecção do conector vaginal é considerado 0,5 dpc. Embora machos vasectomizados podem ser adquiridos a partir de alguns vendedores, o procedimento cirúrgico aqui descrito é relativamente fácil e não necessita de quaisquer instrumentos adicionais do que o necessário para a transferência de embriões.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comittees Beltsville Área (BAACUC 11-015), de acordo com o USDA Animal Care e Use Guidelines. 1. Anestesia e Analgesia (comum para ambos os procedimentos cirúrgicos) Pesar o mouse e colocar os seguintes anestésicos e analgésicos em duas seringas de 1 ml com 27 agulhas L: A cetamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de uma solução a 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0…

Representative Results

Transferência de embriões útero-tubária fornece um meio para transferir os embriões para o útero evitar algumas das complicações associadas à transferência de embriões uterino 2,9,10. Na Tabela 1 mostram algum resultado representante obtivemos transferindo blastocistos CD1 submetidos a diferentes tipos de manipulações para destinatários CD1 seguindo o protocolo descrito. A sobrevivência a termo (% dos embriões resultantes em um cão) ou sobrevivência de E15 (no caso de lentiv…

Discussion

A vasectomia é um procedimento cirúrgico relativamente simples que não envolve grandes dificuldades. Quando saneantes com iodo povidona e etanol ter certeza de que a última lavagem (com etanol) remove iodopovidona, pois pode irritar o peritônio. O acesso ao canal deferente também pode ser alcançado por executar o escroto ou uma incisão no abdómen ^8. Incisão escrotal tem sido recomendado para transversal incisão abdominal devido a incisão menor comparativamente necessário e um pouco melho…

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.