Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

Summary

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

Abstract

La transferencia de los embriones de preimplantación a una hembra sustituto es un paso necesario para la producción de ratones modificados genéticamente o para estudiar los efectos de las alteraciones epigenéticas originadas durante el desarrollo de preimplantación en la posterior desarrollo y adulto fetal salud. El uso de una técnica de transferencia de embriones eficaz y coherente es crucial para mejorar la generación de animales modificados genéticamente y para determinar el efecto de diferentes tratamientos en las tasas de implantación y la supervivencia a largo plazo. Los embriones en la etapa de blastocisto se transfieren generalmente por transferencia uterina, la realización de una punción en la pared uterina para introducir la pipeta de manipulación de embriones. El orificio realizado en el útero no se cierra después de que la pipeta ha sido retirada, y los embriones puede salida a la cavidad abdominal debido a la presión positiva del útero. La punción también puede producir una hemorragia que afecta la implantación, bloquea la pipeta de transferencia y puede afectar el embrión desarrollo, especialmente cuando se transfieren los embriones sin zona. En consecuencia, esta técnica a menudo resulta en tasas de supervivencia bajas embrión muy variables y globales. Evitar estos efectos negativos, la transferencia de embriones útero-tubárica tomar ventaja de la unión útero-tubárica como una barrera natural que impide la salida del embrión y evitar la punción de la pared uterina. Se requieren machos vasectomizados para la obtención de los receptores pseudopreñadas. Una técnica para llevar a cabo la vasectomía se describe como un complemento a la transferencia de embriones útero-tubárica.

Introduction

La transferencia de embriones es probablemente el procedimiento quirúrgico más frecuente se realiza en el modelo de ratón. Esta técnica es esencial para obtener la descendencia a partir de embriones sometidos a técnicas de manipulación in vitro en y, por lo tanto, constituye un paso necesario para el desarrollo de modelos modificados genéticamente mediante inyección pronuclear, la transducción lentiviral, o formación de quimeras. Además, la técnica permite el estudio de los efectos sobre el desarrollo de los diversos insultos que ocurren durante el desarrollo de preimplantación. El uso de técnicas de reproducción artificial ¹ o la exposición a concentraciones anormales de diferentes sustancias o metabolitos ^{02 de mayo} afectar el desarrollo del embrión que resulta en la implantación o placentación fallos y efectos a largo plazo en la descendencia. Una técnica de transferencia de embriones fiable y reproducible es crucial para probar los posibles efectos negativos del tratamiento experimental en la implantación y el desarrollo fetal en un hombre coherentener.

Preimplantación de embriones murinos se pueden transferir a una hembra receptora, ya sea en el oviducto a través de las ampollas de 0,5 días postcoital (dpc) receptores pseudopreñadas (de transferencia) ^3,4 oviducto o al útero de 2,5 dpc pseudopreñada receptor (transferencia uterina) ^5,6 dependiendo de su estado de desarrollo. Los embriones en la etapa de blastocisto, tales como los que se utilizan para generar ratones quiméricos mediante la inyección de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, se transfieren generalmente por transferencia uterina. Los blastocistos pueden también ser transferidos al oviducto de un DPC receptor 0.5, pero constituye una prueba menos fisiológica para los disruptores de desarrollo, debido a que el embrión se somete a diapausa y tiene 2 días para recuperarse de la lesión antes de la implantación tiene lugar. Transferencia uterina implica la punción de la pared uterina con una aguja estrecha con el fin de generar una abertura que permite el acceso de una pipeta de manipulación de embrión en el lumen uterino. Launque esta técnica puede dar buenos resultados, la supervivencia a plazo (es decir, el porcentaje de embriones transferidos que se desarrollan a un cachorro) suele ser baja e impredecible ^7,8.

La perforación de la pared uterina conlleva algunos efectos secundarios perjudiciales. En primer lugar, miometrio es un tejido altamente vascularizado y su punción a menudo resulta en una pequeña hemorragia. La sangre puede bloquear la pipeta de transferencia de embriones o invadir el lumen uterino causando la muerte embrionaria y / o fallo de implantación. Esto es particularmente relevante cuando los embriones se transfieren sin zona, ya que las células de la sangre y los desechos pueden adherirse a los blastómeros. En segundo lugar, la apertura realizada no sella después de que los embriones se han transferido, por lo que puede fluir de vuelta a través del orificio y ser expulsado a la cavidad abdominal cuando un volumen demasiado grande ha sido introducir en el útero. La transferencia de embriones útero-tubárica se describe en el presente documento se aprovechan de la unión útero-tubárica para entregar el EMBRyos en el útero sin la necesidad de perforar la pared uterina y de ese modo evitar sus consecuencias adversas ^9.

Las hembras receptoras pseudopreñadas utilizados para la transferencia de embriones se obtienen mediante monta natural con machos vasectomizados ^8. Las secreciones seminales producidos por un macho estéril son necesarios para el útero a ser receptivo a los embriones transferidos. Para obtener un receptor, un máximo de 2 hembras de 8 semanas a 6 meses de edad se colocan con un hombre sometido a la vasectomía en la tarde. A la mañana siguiente, las hembras se comprueba la presencia de un tapón de la cópula vaginal, un grupo de proteínas coaguladas del líquido seminal masculino. Como el apareamiento ocurre generalmente durante la medianoche, el día de la detección de tapón vaginal se considera 0,5 dpc. Aunque los machos vasectomizados se pueden adquirir en algunos vendedores, el procedimiento quirúrgico descrito en el presente documento es relativamente fácil y no requiere ningún instrumentos adicionales a los requeridos para la transferencia de embriones.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comites Área Beltsville (BAACUC 11-015), de acuerdo con el USDA y Cuidado de Animales Pautas del uso. 1. Anestesia y Analgesia (comunes a los procedimientos quirúrgicos) Pesar el ratón y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos en dos jeringas de 1 ml con 27 g de agujas: La ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de una solución de 10 mg / m…

Representative Results

Transferencia de embriones útero-tubárica proporciona un medio para transferir los embriones al útero para evitar algunas de las complicaciones asociadas a la transferencia de embriones del útero 2,9,10. En la Tabla 1 se muestra algún resultado representante hemos obtenido la transferencia de blastocistos CD1 sometidas a diferentes tipos de manipulaciones a destinatarios CD1 siguiendo el protocolo descrito. La supervivencia a plazo (% de los embriones resultantes en un cachorro) o la sup…

Discussion

La vasectomía es una técnica quirúrgica relativamente sencillo que no implica mayores dificultades. Cuando desinfecte con yodo povidona y etanol asegúrese de que el último lavado (con etanol) elimina la povidona yodada, ya que puede irritar el peritoneo. El acceso a los conductos deferentes también se puede lograr por el escroto o la realización de una incisión transversal en el abdomen ^8. Incisión escrotal ha sido recomendado para transversales incisión abdominal debido a la incisión rela…

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.