内皮细胞小管形成实验的<em>在体外</em>研究血管生成
Summary
小管形成实验是测量在体外血管生成一种快速的，可量化的方法。内皮细胞结合的条件培养基并接种于基底膜提取物。管形成时小时内新形成的小管很容易量化。
Abstract
血管生成是用于正常组织发育和伤口愈合的重要方法，而且还与多种病理状况相关联。通过此协议，血管生成可在体外快速的，可量化的方式进行测量。初级或永生化的内皮细胞被混合的条件培养基并接种于基底膜基质。内皮细胞形成毛细血管样结构响应于在条件培养基中发现的血管生成信号。该管形成迅速发生与血管内皮细胞开始1小时内和含腔，小管开始出现在2个小时的赞同。管可以使用相衬倒置显微镜进行可视化，或者细胞可以与现有的测定法和管通过荧光或共聚焦显微镜观察钙黄绿素AM被处理。的分支站点/节点，回路的数量/网格，或数字或形成管的长度可以很容易地量化为在VITR措施Ø血管生成。总之，本试验可用于确定基因和参与了促进或抑制血管生成中具有快速，可重复的，和定量的方式通路。
Introduction
血管生成，新血管从先前存在的血管的发展，是各种过程，包括器官发育，胚胎发育和伤口愈合1-3至关重要。新开发的血管，内皮细胞，供应氧气和营养物质，内衬以组织，促进造血细胞的免疫监视和清除废物的2,4。血管生成是至关重要的胚胎和胎儿发育过程中。然而，这种方法保持休眠期间除外伤口愈合，骨生长，怀孕次数或月经周期1-3期间在成体中。
在过去的二十年中，调节血管生成的关键分子机制已经开始出现。血管新生是一个严格监管的情况下，通过亲和抗血管生成信号，包括整合，趋化因子，血管生成素，氧传感代理商，交界性分子和内源性抑制剂5平衡。一旦proangiogenic信号，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），血管内皮生长因子（VEGF），血小板衍生生长因子（PDGF），和表皮生长因子（EGF），激活内皮细胞受体的内皮细胞释放的蛋白酶降解基底膜。内皮细胞，然后增殖和迁移，以每6,7天数毫米的速度形成豆芽。
血管生成与多种病理状况，包括癌症，牛皮癣，糖尿病性视网膜病，关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，感染性疾病，动脉粥样硬化和8-10相关联。由于血管生成的各种疾病的重要性，了解调节这一过程是更好的治疗设计的关键基因和途径。
在管道形成试验是一种快速和定量的方法，用于确定参与血管生成基因或通路。于1988年首先描述，此测定法的基本原则是内皮细胞保持分裂和迅速地响应于血管生成的信号11-13迁移的能力。此外，血管内皮细胞被诱导分化和形成管样结构，当上的基底膜提取物（BME）的基质中培养。这些管道包括通过连接复合体连在一起的内皮细胞围成的管腔。管形成很快发生最管在该测定中形成内2-6小时，这取决于数量和血管生成的刺激的类型。
几种类型的内皮细胞可用于该测定中既包括原代细胞和永生化细胞系14,15。本文使用的细胞系是小鼠3B-11，但是相同的方法可以与其他内皮细胞系如SVEC4-10（小鼠）或原代内皮细胞，例如血管内皮细胞（人）的细胞被应用。这取决于细胞系用于与是否内皮策LLS转化或未转化，优化将需要被进行，以确定所需要的适当的管道形成了理想的时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管生成是涉及在生理和病理过程。研究参与血管生成的机制要求使用概括在血管生成中的重要步骤测定的。内皮细胞管形成测定提供了几个优点优于其它试验。很容易设置，是比较廉价，生产小时内小管，并且是可量化的。此外，它可以在24位或96孔板内完成，因此可用于高通量筛选，以确定该刺激因子或抑制血管生成。虽然我们用3B-11小鼠内皮细胞为我们的实验中，测定可与各种人或鼠内?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由美国国家癌症研究所在美国国立卫生研究院院内研究计划的一部分得到了支持，并通过新华保险给予UA5CA152907。
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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