Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em> In Vitro</em> Estudio de la angiogénesis
Summary
El ensayo de formación de tubo es un método rápido, cuantificable para medir la angiogénesis in vitro. Las células endoteliales se combinan con los medios condicionados y se sembraron en extracto de membrana basal. La formación del tubo se produce dentro de horas y los túbulos recién formadas cuantificarse fácilmente.
Abstract
La angiogénesis es un proceso vital para el desarrollo del tejido normal y la curación de heridas, pero también se asocia con una variedad de condiciones patológicas. Usando este protocolo, la angiogénesis se puede medir in vitro de una manera rápida, cuantificable. Células endoteliales primarias o inmortalizadas se mezclan con medio condicionado y se sembraron en la matriz de la membrana basal. Las células endoteliales forman estructuras similares a capilares en respuesta a señales angiogénicas que se encuentran en los medios condicionados. La formación del tubo se produce rápidamente con células endoteliales comenzando a alinearse dentro de 1 hora y túbulos que contienen lumen-comenzando a aparecer dentro de 2 horas. Los tubos pueden ser visualizados utilizando un microscopio invertido de contraste de fase, o las células pueden ser tratadas con calceína AM antes del ensayo y tubos visualizado a través de fluorescencia o microscopía confocal. El número de sitios de sucursal / nodos, bucles / mallas, o el número o la longitud de los tubos formados pueden ser fácilmente cuantificado como una medida de en vitro angiogénesis. En resumen, este ensayo se puede usar para identificar los genes y las vías que están involucrados en la promoción o inhibición de la angiogénesis en una manera rápida, reproducible y cuantitativo.
Introduction
La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, es vital para una variedad de procesos que incluyen el crecimiento de órganos, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y 1-3. Nuevo desarrollo de los vasos sanguíneos, se alinearon por las células endoteliales, el suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos, la promoción de la vigilancia inmunológica de las células hematopoyéticas y eliminar los productos de desecho 2,4. La angiogénesis es de vital importancia durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, este proceso permanece latente en el adulto, excepto en tiempos de cicatrización de heridas, el crecimiento del esqueleto, el embarazo o durante el ciclo menstrual 1-3.
En las últimas dos décadas, los mecanismos moleculares que regulan la angiogénesis clave han comenzado a surgir. La angiogénesis es un evento estrictamente regulados, equilibrada por señales pro y antiangiogénicos, que incluyen las integrinas, quimiocinas, angiopoyetinas, agentes de detección de oxígeno, moléculas de unión y los inhibidores endógenos 5. Una vez proangiogenic señales tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) activan los receptores de las células endoteliales de las células endoteliales liberan proteasas para degradar la membrana basal. Las células endoteliales proliferan y migran a continuación, la formación de brotes a una velocidad de varios milímetros por día 6,7.
La angiogénesis está asociada con diversas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, psoriasis, retinopatía diabética, artritis, asma, trastornos autoinmunes, enfermedades infecciosas, y la aterosclerosis 8-10. Debido a la importancia de la angiogénesis en diversas enfermedades, la comprensión de los genes y las vías que regulan este proceso es fundamental para el diseño de mejores terapias.
El ensayo de formación de tubo es un método rápido y cuantitativo para la determinación de genes o rutas implicadas en la angiogénesis. Descrita por primera vez en 1988,los principios subyacentes de este ensayo son que las células endoteliales conservan la capacidad de dividirse y migrar rápidamente en respuesta a las señales angiogénicas 11-13. Además, las células endoteliales son inducidas a diferenciarse y formar estructuras similares a tubos cuando se cultivan sobre una matriz de extracto de membrana basal (BME). Estos tubos contienen un lumen rodeado por las células endoteliales unidas entre sí a través de complejos de unión. La formación del tubo se produce rápidamente con la mayoría de los tubos que forman en este ensayo a las 2-6 horas dependiendo de la cantidad y tipo de estímulos angiogénicos.
Varios tipos de células endoteliales pueden ser utilizados para este ensayo incluyendo tanto células primarias y líneas celulares inmortalizadas 14,15. La línea celular utilizada para este artículo fue ratón 3B-11, pero la misma metodología se puede aplicar con otras líneas de células endoteliales tales como SVEC4-10 (ratón) o células endoteliales primarias tales como las células HUVEC (humanos). Dependiendo de la línea celular se utiliza y si el ce endotelialLLS se transforman o no transformadas, tendrá que ser llevado a cabo para identificar el momento ideal necesaria para la formación correcta del tubo de optimización.
Protocol
Representative Results
Discussion
La angiogénesis está implicada en los procesos fisiológicos y patológicos. El estudio de los mecanismos implicados en la angiogénesis requiere el uso de ensayos que recapitular los pasos principales en la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial ofrece varias ventajas sobre otros ensayos. Es fácil de configurar, es relativamente barato, produce túbulos en cuestión de horas, y es cuantificable. Además, se puede completar en 24 ó 96 placas de pocillos, y por lo tanto se puede utilizar pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, y por el NCI concede UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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