Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em> במבחנה</em> חקר אנגיוגנזה
Summary
Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.
Abstract
אנגיוגנזה היא תהליך חיוני להתפתחות רקמות נורמלית וריפוי פצעים, אלא גם קשורה עם מגוון רחב של מצבים פתולוגיים. שימוש בפרוטוקול זה, אנגיוגנזה ניתן למדוד במבחנה באופן מהיר, לכימות. תאי האנדותל ראשוניים או הונצחו מעורבבים עם תקשורת מותנית ומצופים על מטריצת קרום במרתף. תאי האנדותל יוצרים נימים כמו מבנים בתגובה לאנגיוגנזה אותות מצאו בתקשורת מותנית. היווצרות הצינור מתרחשת במהירות עם תאי האנדותל מתחילים ליישר את עצמם בתוך שעה 1 וצינוריות המכיל לומן מתחילים להופיע בתוך 2 שעות. יכולים להיות דמיינו צינורות באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפוך שלב, או ניתן לטפל בתאים עם AM calcein לפני assay והצינורות דמיינו באמצעות הקרינה או confocal. מספר אתרי סניף / צמתים, לולאות / רשתות, או מספר או אורך של צינורות שנוצרו ניתן לכמת בקלות כמדד בvitrאנגיוגנזה o. לסיכום, assay זה יכול לשמש כדי לזהות גנים ומסלולים המעורבים בקידום או העיכוב של אנגיוגנזה בצורה מהירה, לשחזור, וכמותי.
Introduction
אנגיוגנזה, הפיתוח של כלי דם חדשים מכלי preexisting, הוא חיונית עבור מגוון רחב של תהליכים לרבות גידול איברים, התפתחות עוברית, וריפוי פצע 1-3. חדש שפותח כלי דם, בשורה של תאי האנדותל, חמצן אספקה וחומרים מזינים לרקמות, לקדם מעקב חיסוני על ידי תאי hematopoietic ולהסיר חומרי פסולת 2,4. אנגיוגנזה היא בעל חשיבות מרכזית בהתפתחות עוברית ועוברית. עם זאת, תהליך זה נשאר רדום במבוגרים, למעט בתקופות של ריפוי פצעים, צמיחת שלד, הריון או במהלך המחזור החודשי 1-3.
במהלך שני העשורים האחרונים, מנגנונים מולקולריים מרכזיים המסדירים אנגיוגנזה החלו לצוץ. אנגיוגנזה היא אירוע בחוזקה מוסדר, מאוזנת אותות פרו וantiangiogenic כוללים integrins, כמוקינים, angiopoietins, סוכני חישת חמצן, מולקולות junctional ומעכבי אנדוגני 5. ברגע שproangאותות iogenic כגון גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF), גורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), גורם גדילה המופק טסיות דם (PDGF), וגורם הגדילה באפידרמיס (EGF) להפעיל תא האנדותל קולטניים תאי האנדותל לשחרר פרוטאזות להשפיל קרום במרתף. תאי האנדותל אז להתרבות ולהעביר, ויצרו נבטים בשיעור של כמה מילימטרים ליום 6,7.
אנגיוגנזה קשורה למצבים פתולוגיים שונים, כוללים סרטן, פסוריאזיס, רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים, אסטמה, הפרעות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות, וטרשת עורקת 8-10. בשל החשיבות של אנגיוגנזה במחלות שונות, הבנת גנים ומסלולים המווסתים את התהליך הזה הוא קריטי לעיצוב של תרופות טובות יותר.
Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה וכמותיים לקביעת גנים או מסלולים מעורבים באנגיוגנזה. תואר לראשונה בשנת 1988,העקרונות שבבסיס assay זה הם שתאי האנדותל שומרים על היכולת להתחלק ולהעביר במהירות בתגובה לאותות angiogenic 11-13. יתר על כן, בתאי האנדותל הנגרמים לבדל וליצור מבנים דמויי צינור כאשר בתרבית על מטריצה של תמצית קרום במרתף (BME). צינורות אלה מכילים לומן מוקף בתאי האנדותל המקושרים ביניהם באמצעות מתחמי junctional. היווצרות צינור מתרחשת במהירות עם רוב הצינורות ויוצרים בassay זה בתוך 2-6 שעות בהתאם לכמות וסוג של גירויי אנגיוגנזה.
מספר סוגים של תאי האנדותל יכולים לשמש עבור assay זה כולל שני תאים ראשוניים ושורות תאים הונצחו 14,15. שורת התא המשמשת למאמר זה הייתה עכבר 3B-11, אך אותן השיטות יכולות להיות מיושמת עם קווים אחרים אנדותל תא כגון SVEC4-10 (עכבר) או תאי האנדותל עיקריים כגון HUVEC תאים (אדם). תלוי באיזה קו סלולארי משמש והאם ce אנדותלLLS הופכים או לא הופך, אופטימיזציה תצטרך להתנהל כדי לזהות את הזמן האידיאלי נחוץ להיווצרות צינור נכונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנגיוגנזה היא מעורבת בשני תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. חקר מנגנונים המעורבים באנגיוגנזה דורש השימוש במבחנים שיסכמו את השלבים העיקריים באנגיוגנזה. Assay היווצרות צינור תא האנדותל מציע מספר יתרונות על פני מבחני אחרים. זה קל להגדרה, הוא זול יחסית, מייצר tubules בתוך שעות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תכנית מחקר המיפוי של המכון הלאומי לסרטן במכון הלאומי לבריאות, ועל ידי NCI להעניק UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
